1、第 卷 第 期 年北京化工大学学报（自然科学版）（），引用格式：汪春江，李昇原，黄永鹏，等 纳米碳酸钙负载奥曲肽可吸入缓释制剂研究 北京化工大学学报（自然科学版），（）：，（），（）：纳米碳酸钙负载奥曲肽可吸入缓释制剂研究汪春江 李昇原 黄永鹏 唐 慧 张建军 陈 博（国民核生化灾害防护国家重点实验室，北京；北京化工大学 化学工程学院，北京）摘 要：采用复分解法制备了 种不同微观形貌的纳米级碳酸钙，研究了添加剂聚丙烯酸（）和聚天冬氨酸钠（）的引入对碳酸钙微观形貌和物相结构的影响；以纳米碳酸钙材料作为药物载体，通过浸渍吸附冷冻干燥工艺装载药物奥曲肽，构建了可吸入缓释微粉制剂；测试了碳酸钙载体材料
2、的理化性能及体内生物效应，考察了微粉制剂的微观形貌、载药量、体外释药性能、体外吸入沉积性能。结果表明：添加剂的引入可以实现对碳酸钙粒径、微观形貌和物相结构的调控；纳米碳酸钙载体能够有效负载奥曲肽，所制备的微粉制剂保持了载体原有的形貌；在所制备的 种纳米碳酸钙载体材料中，由球形与棒形混杂状纳米碳酸钙载体制备的微粉制剂的综合性能最佳，其载药量为.，有效部位沉积率达到，持续释药时间达到，具有较好的体外吸入沉积性能和体外释药性能；球形与棒形混杂状纳米碳酸钙对 细胞无毒性，低浓度时不会引起炎症效应，并且可以将药物有效地递送至肺部并在肺部滞留 ，具有作为可吸入缓释制剂载体的潜力。关键词：纳米碳酸钙；奥曲肽
3、；聚天冬氨酸钠；吸入制剂；缓释制剂中图分类号：.：收稿日期：基金项目：青年科技英才自主基金（）第一作者：男，年生，硕士生通信联系人张建军，：陈博，：引 言奥曲肽（，）是由 个氨基酸组成的环状多肽，是一种生长抑素类药物，能够选择性抑制生长激素、胰血糖素、胰岛素的分泌，是临床上治疗肢端肥大症的首选药物，此外还可用于治疗消化道出血、内分泌肿瘤等疾病。通常需要长期用药，且口服时药物稳定性差，目前主要的给药形式为静脉注射和皮下注射。长期频繁的注射导致患者依从性降低，并容易引发细胞组织感染，因此迫切需要非侵入性的给药方式及其制剂。人体肺泡 毛细血管区域的吸收面积大、血流丰富、交换距离短、酶降解作用弱，因此
4、肺部给药被认为是多肽药物理想的新型给药方式。其中，干粉吸入制剂是利用吸入装置与患者呼吸的气流作用将微粉化药物递送至肺部的制剂形式，具有携带方便、操作简单、干扰因素少、药剂稳定性好、生物利用率高、递送剂量准确等优点，因此在新药及新剂型研发领域广受瞩目。目前，国内外 吸入制剂的相关研究较少，并且均处于起步阶段。本课题组此前探索性开展了针对肢端肥大症的无载体 干粉吸入制剂研究，结果表明 吸入制剂能够达到与皮下注射几乎相同的生物利用度，证明这种新的给药途径与制剂形式具有可行性，但是由于该微粉制剂没有缓释作用，因此药物的半衰期较短。利用载体材料负载 制备可吸入缓释制剂，能够同时结合吸入制剂和缓释制剂的优
5、点，在避免侵入性给药的同时延长药物作用时间、减少给药频率。近年来，将纳米碳酸钙（）用于药物载体的相关报道引起了研究者的关注，基于纳米碳酸钙的药物递送系统能够有效负载小分子药物及蛋白并实现缓释、控释的效果，但给药途径仍以传统的注射或口服方式为主。纳米碳酸钙具有生物相容性好、比表面积大、孔隙率高等优点，理论上是用于吸入制剂的理想载体材料，但目前尚无相关文献报道。复分解法是制备纳米碳酸钙最常用的方法，即利用水溶性钙盐与水溶性碳酸盐在溶液中反应得到纳米碳酸钙载体，通过引入聚丙烯酸（，）、聚乙二醇（）等添加剂，能够改变纳米碳酸钙的微观形貌与物相结构，进而可能会对吸入制剂的吸入性能与释放性能产生影响。本研
6、究采用复分解法制备用于干粉吸入制剂的纳米碳酸钙载体，创新性引入聚天冬氨酸钠（，）等作为添加剂实现对碳酸钙载体形貌与晶型的调控；通过浸渍吸附冷冻干燥工艺装载，构建可吸入缓释微粉制剂；对载体材料与吸入制剂进行微观形貌、物相结构、递送与释放、生物效应等研究，以期为 提供一种新的药物递送方案。实验部分.实验材料与仪器.实验材料奥曲肽，纯度.，浙江湃肽生物有限公司，批号；吸入 乳糖（粒径 ）、十水碳酸钠、二水氯化钙、盐酸、氢氧化钠，化学纯，北京化工厂；聚丙烯酸（分子量 ）、聚天冬氨酸钠（分子量 ），阿拉丁试剂（上海）有限公司；纳米氧化铜（，粒径 ，球形，纯度.）、氨丙基三乙氧基硅烷（，纯度）、羟基琥珀酰
7、亚胺（，纯度）、乙基（二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（，纯度.）、酪氨酸（，纯度）、，四氯，二苯基甘脲（，纯度），上海麦克林生化科技股份有限公司；，北京原子高科股份有限公司；细胞、完全培养基（含 胎牛血清（），武汉普诺赛生物科技有限公司；细胞毒性试剂盒、检测试剂盒，上海钦诚生物科技有限公司；小鼠模型，雄性，北京思科诺思生物科技有限公司。.实验仪器 型真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；型比表面积及孔径分析仪，贝士德仪器科技（北京）有限公司；型扫描电子显微镜（），日本日立公司；型场发射透射电子显微镜（），美国 公司；型 射线衍射仪（），德国布鲁克公司；型高效液相色谱仪（），美国安捷伦公
8、司；型安德森级联撞击器（），北京明杰蓝天科技有限公司；型动态光散射纳米激光粒度仪，丹东百特仪器有限公司；型纳米粒度电位仪，英国马尔文仪器有限公司；型 成像系统，荷兰 公司；型细胞培育箱，美国 公司。.碳酸钙载体的制备以在不加添加剂的条件下制备的碳酸钙 作为对比，同时选用 和 作为添加剂制备了 种不同微观形貌的纳米碳酸钙，并对交联时间、滴加速度、反应时间、离心时间等条件进行了优化，得到最佳制备条件如下：菱方形碳酸钙 配制.碳酸钠溶液和.氯化钙溶液，取碳酸钠溶液和氯化钙溶液各 ，在搅拌下将碳酸钠溶液以 的速 度 滴 加 至 氯 化 钙 溶 液 中。滴 加 结 束 后 在 的转速下反应 ，反应结束后
9、将悬浮液在 的转速下离心，用水和乙醇洗涤、离心后，在 下干燥至恒重。棒形纳米碳酸钙 选用 作为添加剂加入碳 酸 钠 溶 液。取.碳 酸 钠 溶 液 和.氯化钙溶液各 ，向碳酸钠溶液中加入 的 并搅拌交联 ，然后在搅拌下将添加 的碳酸钠溶液以 的速度滴加 至 氯 化 钙 溶 液 中。滴 加 结 束 后 于 室 温 在 的转速下反应 ，反应结束后将悬浮液在 的转速下离心，用水和乙醇洗涤、离心后，在 下干燥至恒重。球形纳米碳酸钙 选用 作为添加剂与氯化钙交联。取.碳酸钠溶液和.氯化钙溶液各 ，向氯化钙溶液中加入 的 并搅拌交联 ，然后在搅拌下将碳酸钠溶液以 的速度滴加至添加 的氯化钙溶液中。滴加结束
10、后于室温在 的转速 下 反 应 ，反 应 结 束 后 将 悬 浮 液 在 的转速下离心 ，用水和乙醇洗北京化工大学学报（自然科学版）年涤、离心后，在 下干燥至恒重。球棒混杂状纳米碳酸钙 选用 作为添加剂与氯化钙交联，作为添加剂加入碳酸钠溶液。取.碳酸钠溶液和.氯化钙溶液各 ，向氯化钙溶液中加入 的，向碳酸钠溶液中加入 的 并搅拌交联 ，然后在搅拌下将添加 的碳酸钠溶液以 的速度滴加至添加 的氯化钙溶液中。滴加结束后于室温在 的转速下反应 ，反应结束后将悬浮液在 的转速下离心 ，用水和乙醇洗涤、离心后，在 下干燥至恒重。.碳酸钙载体的测试与表征采用纳米激光粒度仪测定反应结束后悬浮液中碳酸钙颗粒的
11、 均粒径和多分散指数（），以水为分散介质，平衡温度为 ；采用扫描电子显微镜观察碳酸钙粉末的微观形貌；采用场发射透射电子显微镜表征干燥后碳酸钙粉末的微观形貌与结构；采用 射线衍射仪表征碳酸钙粉末的物相结构，操作电压 ，操作电流 ，靶，波长.，扫描范围 ，扫描速率（）；采用比表面积及孔径分析仪测定碳酸钙粉末的比表面积与孔径；采用纳米粒度电位仪测量碳酸钙粉末的 电势，以水为分散介质，平衡温度为。.可吸入缓释微粉制剂的制备配制 的 水溶液，取 的 溶液分别加入 不同的碳酸钙载体，超声，然后在 的转速下持续吸附 。将 溶液与纳米碳酸钙的混合物过滤，分离固体后用超纯水洗涤 次，冷冻干燥，得到碳酸钙负载 的
12、微粉制剂。将碳酸钙、制备的微粉制剂分别记为、。.可吸入缓释微粉制剂的性能分析.载药量称取少量微粉制剂置于烧杯中，加入超纯水后以 的转速搅拌，然后超声。静置后吸取上清液，通过.滤膜过滤后，采用 进行定量分析。色谱柱为安捷伦 柱，流动相为乙腈与.（体积分数）高氯酸水溶液的混合液（二者体积比为 ），检测波长为 。根据式（）计算载药量。（）式中：为微粉制剂的质量，；为微粉制剂中所含药物的质量，。.体外释放曲线以超纯水（.）作为溶出介质，称取适量微粉制剂置于透析袋中并加水至充满，用夹子封紧两端后浸没于 溶出介质，在 下以 的转速搅拌。搅拌开始后在、取样并补充溶出介质，通过 对样品进行定量分析。根据式（）
13、计算微粉制剂的溶出度，并绘制时间溶出度体外释放曲线。（）式中：、分别为第 次取样时和第 次（最后一次）取样时药物的质量浓度，；为各时间点的固定取样体积，；为溶出介质的体积，。.排空率和有效部位沉积率采用安德森级联撞击器 测定微粉制剂的排空率（，）和有效部位沉积率（，）。将微粉制剂与适量的乳糖混合均匀后装入胶囊中，称取 粒胶囊（约 ）置 于 吸 入 器 后 连 接。刺 破 胶 囊 并 以.的气流流速抽吸 ，间隔 后复吸，重复 次。用超纯水回收被 中各级截留的微粉制剂，通过 进行定量分析，根据式（）和式（）计算 和。（）（）式中：为 中收集到的第 级的 质量浓度，；为收集到的第 级的 体积，。.纳
14、米碳酸钙载体的生物效应测定.细胞毒性载体进入肺部后会在肺部与巨噬细胞发生相互作用，产生生物学效应。选用 细胞系为细胞第 期 汪春江等：纳米碳酸钙负载奥曲肽可吸入缓释制剂研究模型，经诱导分化后，用 完全培养基（含 ）分别配制质量浓度为.、的纳米碳酸钙 和纳米氧化铜悬浮液。将细胞在 、培育箱中在 个细胞 孔、培养基 孔的条件下培育。培育结束后吸取孔板中的上清液并弃掉，向其中分别加入纳米碳酸钙 悬浮液、纳米氧化铜悬浮液和培养基，在相同条件下培育 后通过 细胞毒性试剂盒检测细胞活性。以未加入任何颗粒物的细胞为空白对照，以细胞毒性很强的纳米氧化铜为阳性对照，通过细胞活性分析纳米碳酸钙 的细胞毒性。.炎性
15、效应巨噬细胞是体内炎症调控的重要单元，当外来物突破机体的物理屏障（如皮肤、黏膜等）时，细胞膜表面 样受体激活，经由 通路指导 的合成，在细胞核指导细胞因子（如白介素、及肿瘤坏死因子 等）的合成，产生免疫细胞应答。选择 和 两种细胞因子作为免疫炎症的标志物，研究纳米碳酸钙 引发的肺部炎性效应。将配制的纳米碳酸钙 悬浮液与细胞孵育 后，吸取细胞上清液并用 检测试剂盒检测其中的 和 含量。.体内分布碳酸钙具有丰富的表面羟基，可运用 法将放射性 标记在颗粒物表面，具体的标记策略如图 所示。在清洗掉游离的 后，以 小鼠为动物模型，将核素标记的颗粒物通过肺部滴灌的方式，按照 只的剂量递送至小鼠肺部。通过
16、成像系统观察纳米碳酸钙 进入肺部后在不同时间的体内分布情况。结果与讨论.纳米碳酸钙的制备过程分析采用复分解法制备纳米碳酸钙时，添加剂可与钙离子或碳酸根离子耦合形成复合物，复合物随着交联时间的延长而形成胶体粒子，添加剂在结晶过程中影响晶胞的形成，诱导形成具有不同晶型与形貌的碳酸钙并抑制其向其他晶型转化。是合成纳米碳酸钙常用的添加剂，有关机理的研究较为成熟。是工业上常用的阻垢剂，能够与钙离子螯合抑制钙盐结垢。以 作为添加剂制备纳米碳酸钙 的过程如图 所示，碳酸钙图 纳米碳酸钙的核素标记策略 在反应体系中的 均粒径与多分散指数如表 所示。碳酸钙 的 均粒径大于纳米碳酸钙、，且多分散指数偏大（.），粒径均一性较差。图 纳米碳酸钙 的制备过程 表 不同碳酸钙载体材料的 均粒径及多分散指数 碳酸钙载体添加剂 均粒径 多分散指数碳酸钙 无.纳米碳酸钙.纳米碳酸钙.纳米碳酸钙 .碳酸钙载体材料的表征结果.微观形貌不同碳酸钙载体材料的微观形貌如图 所示。北京化工大学学报（自然科学版）年碳酸钙 由粒径约.的实心菱方形碳酸钙组成；纳米碳酸钙 由长约 、宽约 的棒形碳酸钙组成，棒形碳酸钙中存在孔道结构；纳米碳
