1、技术与方法生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(6):171-180收稿日期:2022-11-01 基金项目:国家自然科学基金项目（31872287）作者简介:孟国强，男，硕士研究生，研究方向：生物学；E-mail: 通讯作者:韦有恒，男，博士，教授，研究方向：果蝇细胞代谢及生长发育；E-mail:RagA 转基因果蝇的构建及功能研究孟国强 管建文 牛春梅 周颖 沈苏林 韦有恒（扬州大学生物科学与技术学院，扬州 225000）摘 要：Rag GTPase 属于 Ras 家族成员的 GTP 结合蛋白，定位于溶酶体。果蝇 RagA 蛋白是哺乳动物 RagA/Rag
2、B 蛋白同源物，在果蝇中 RagA 与 RagC 结合，共同调节 TORC1 活性。本实验室发现敲减 RagA 使果蝇发育停滞在蛹期。为了探究具体原因，基于密码子的简并性，通过融合 PCR、同源重组克隆的方法构建了改变 RagA RNA 干扰靶标位点的过表达载体 pUASp-RagA-wt；在此基础上，通过点突变的方式构建了与 GTP 结合的 RagA 过表达载体 pUASp-RagA-Q61L 和与 GDP 结合的 RagA 过表达载体pUASp-RagA-T16N。通过显微注射和遗传杂交等方式分别筛选出 pUASp-RagA-wt、pUASp-RagA-Q61L、pUASp-RagA-T1
3、6N 转基因果蝇。通过体细胞克隆的方法检测了不同活性状态的 RagA 对 TORC1 活性的影响，RagA 调节 TORC1 活性：与 GTP 结合处于激活态；与 GDP 结合处于失活态。为确定 GTP/GDP 状态下 RagA 活性对果蝇发育的影响，将 UASp 转基因系果蝇与 Tub-Gal4/TM6 果蝇杂交并统计后代羽化率，判断由 GTP/GDP 状态控制的 RagA 活性对果蝇生长发育的影响。结果发现，RagA 敲减果蝇由于蛹期阶段内出现障碍不能发育为成虫。在 RagA 敲减的背景下，过表达野生型 RagA 能够完全挽救 RagA 敲减所导致的果蝇致死。过表达GTP 结合型的 Rag
4、A-Q61L 能够部分挽救 RagA 敲减的致死效应，过表达 GDP 结合型的 RagA-T16N 不能挽救 RagA 敲减的致死效应。表明 RagA 在果蝇生长发育过程中起着重要的作用，且 RagA 与 GTP/GDP 结合需保持动态平衡。RagA 仅与 GTP 或 GDP 结合会使TORC1 活性处于过高或过低的状态，影响果蝇的生长发育。关键词：RagA；显微注射；果蝇；发育DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2022-1341Construction and Functional Study of RagA Transgenic DrosophilaMEN
5、G Guo-qiang GUAN Jian-wen NIU Chun-mei ZHOU Ying SHEN Su-lin WEI You-heng（College of Bioscience and Biotechnology,Yangzhou University,Yangzhou 225000）Abstract:Rag GTPase is GTP-binding proteins belonging to a member of the Ras family and localizes on lysosomes.Drosophila RagA protein,a homologue of
6、mammalian RagA/RagB protein,forms a complex with RagC to regulate TORC1 activity.Here we found that knockdown of RagA caused Drosophila development to stagnate at the pupal stage.To explore the function of RagA on Drosophila development,we constructed the overexpressing vector pUASp-RagA-wt with Rag
7、A RNA interfering target sites changed.On this basis,the GTP-binding RagA-overexpressed plasmid pUASp-RagA-Q61L and the GDP-binding RagA-overexpressed plasmid pUASp-RagA-T16N were constructed by point mutation.The pUASp-RagA-wt,pUASp-RagA-Q61L and pUASp-RagA-T16N plasmids were screened by microinjec
8、t and screentransgene lines.The effects of different forms of RagA on the TORC1 activity were evaluated by the method of somatic cell cloning,RagA regulated the TORC1 activity,and it was in the activated state after binding with GTP,and inactivated after binding with GDP.To determine the effects of
9、RagA activity on the Drosophila development under GTP/GDP state,the UASp transgene lines were crossed with Tub-Gal4/TM6 and the eclosion rate of offspring was counted.The results showed that Drosophila with RagA knockdown failed to develop into adults due to obstacles in the pupal stage.The overexpr
10、ession of wild-type RagA completely avoided the death of Drosophila caused by RagA knockdown,confirming that depletion of RagA was the cause of developmental defects in RagA RNAi.The overexpression of GTP-bound RagA-Q61L partially reduced the lethal effect 生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No
11、.6172黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）作为经典遗传学和分子遗传学模式生物，已经成为研究基因调控器官发育以及各种疾病发生的良好模型1。2000 年，果蝇全基因组测序基本完成，全基因组约165 Mb，编码蛋白的基因有 13 600 种（人类基因组约 3 300 Mb，约有 30 000 个基因）。果蝇中约有一半的蛋白质与哺乳动物中蛋白质具有序列同源性2，超过 75%的与人类疾病相关基因在果蝇中具有同源物，尤其对于肿瘤、神经疾病、畸形综合征、代谢异常等疾病相关基因，果蝇和人类具有很大相关性。因此，果蝇可以作为研究基因功能的良好模型3-4。果蝇属于完全变态发育，需经历卵、
12、幼虫、蛹和成虫 4 个阶段。其中幼虫又分为一龄、二龄、三龄 3 个时期。一只雌果蝇一天能产 100-200 个 0.5 mm 的卵，受精卵在温度为 25、相对湿度为 60%环境下，第 1 天发育为一龄幼虫5。然后开始进食，蜕皮，不断生长，第 2 天发育为二龄幼虫。经过再次蜕皮、生长发育，第 3 天发育为三龄早期幼虫，随后在第 4 天发育为三龄中期幼虫，第 5 天发育为三龄晚期幼虫。第 6 天形成早期蛹，早期蛹为白色，之后颜色加深变为深褐色。第 7 天形成中期蛹，第8 天形成晚期蛹，第 9 天形成隐成虫，第 10 天破蛹为成虫。果蝇在实验室培养条件下，可存活达 50-70 d6-7。RagA 最
13、初被鉴定为酵母 Gtr1 的功能同源物，属于 Ras 家族成员的 GTP 结合蛋白，定位于溶酶体8-9。果蝇 RagA 蛋白是哺乳动物 RagA/RagB 蛋白同源物，与 RagC 形成 Rag GTPases 复合体共同调节 target of rapmaycin complex 1（TORC1）活性10。TORC1 是细胞感受营养水平，控制细胞代谢的关键复合体11-12，也是控制细胞自噬的关键信号通路13-14。在氨基酸充足的条件下，RagA 与 GTP 结合而 RagC 与 GDP 结合，Rag 复合体处于活性状态，从而将细胞质基质中游离的 TORC1 蛋白招募到溶酶体上，使 TORC1
14、 被溶酶体上的 Rheb 蛋白激 活15-16。而当 RagA 与 GDP 结合，RagC 与 GTP 结合 时，则 Rag 复合体处于失活状态，不能促进 TORC1的活性。将 RagA 蛋白中 61 位的谷氨酰胺突变为亮氨酸（Q61L）可以使 Rag 复合体处于与 GTP 结合的活化态，招募并激活 TORC1；而将 RagA 蛋白中 16位的苏氨酸位突变为天冬酰胺（T16N）使 Rag 复合体处于与 GDP 结合的失活态，不能激活 TORC117。本实验以黑腹果蝇为材料，分别构建 RNA 干扰靶位点、GTP/GDP 结合位点突变的果蝇 RagA 基因表达载体，通过显微注射、遗传杂交获得不同活
15、性状态的转基因果蝇；以 RagA 基因敲减果蝇为对象，综合利用遗传杂交、基因表达分析等方法，通过表达不同活性状态的 RagA，对 RagA 敲减果蝇的回复效果进行分析，明确 RagA 调节果蝇生长发育方面的功能以及 RagA 不同活化状态对果蝇发育的影响。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 果蝇品系 UAS-RagA RNAi（3 号染色体）转基因果蝇购于清华大学果蝇中心、SP/SM6;MKRS/TM6（2、3 号染色体平衡子果蝇）、SP/SM6;UAS-RagA RNAi/TM6（本实验室制备）、w1118 为野生型果蝇、attP40（定点二号染色体的显微注射果蝇）、Tub-Gal4/TM
16、6（Tub-Gal4 为全身表达，纯合致死，带 TM6 平衡染色体）、UAS-mCherry RNAi（对照果蝇，3 号染色体）以上果蝇均为实验室保种品系。1.1.2 质粒 pUASp-attB：带红眼标记基因、含UAS 元件和 HA 标签，制备定点转基因果蝇。1.1.3 试剂 One Step Mouse Genotyping Kit（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），2Phanta Max Master Mix（Dye Plus）（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），GoldHi EndoFree Plasmid Midi Kit（康为世纪生物科技有限公司），Gel Extraction Kit（康为世纪生物科技有限公司），限制性核酸内切酶（New England of Drosophila with RagA knockdown,while the overexpression of GDP-bound RagA-T16N could not decrease the lethal effect of Drosophila with RagA knockdown at all.Ou
