1、 世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.实验研究：基金项目：山西省重点研发计划项目（）；山西省医学重点科研项目（）；中央引导地方科技发展基金项目（）作者单位：山西中医药大学中西医结合基础实验室，山西 晋中 通信作者：郝慧琴，：傅山风湿外治方防治类风湿关节炎安全性的实验研究肖冰 徐烨 李思源 刘杨 郝慧琴【摘要】目的 探讨傅山风湿外治方（）防治类风湿关节炎的安全性。方法 将 只 级 雌性大鼠采用随机数字表法分为刺激破损组（）、刺激完整组（）保持 ；过敏对照组（凡士林 ）、过敏治疗组（）、过敏阳性组（）保持 ，第、天各重复 次，第 天将给药量改为凡士林 、给药 次，保持 ；急毒对照组（凡士林
2、 ）、急毒完整组（）、急毒破损组（）每 给药 次，共 次；慢毒对照组（凡士林 ）、慢毒完整组（）、慢毒破损组（）给药 次，共 周。观察各组大鼠一般情况，皮肤红斑、水肿和恢复情况，中毒情况和死亡情况，以及各过敏组过敏反应情况。检测慢毒各组给药后及停药 周后大鼠血清中丙氨 酸氨基转氨酶（，）、天冬氨酸安基转氨酶（，）、血尿素氮（，）的含量。结果实验过程中未见大鼠死亡，除过敏阳性组可见明显过敏反应，其他各组均未见明显皮肤红斑、水肿；急毒和慢毒各组大鼠体重均随时间稳定增长；慢毒对照组给药后及停药 周后 浓度变化，差异有统计学意义（），其他慢毒各组大鼠血清中、浓度同期各组及同组前后比较，差异无统计学意义
3、（），除给药过程中慢毒破损组大鼠、浓度略高于正常值且停药后恢复，其他各组、浓度均在正常值范围。结论 外用对皮肤无刺激性、致敏性和急性毒性，对破损皮肤长期给药可能会导致轻微的可逆肝肾损伤。【关键词】傅山风湿外治方；安全性；外治法；类风湿关节炎【中图分类号】【文献标识码】，（，）【】（）（）（）（），（），（），（），（），（）（），（），（），（），（），（），（），世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.（），【】；类风湿性关节炎（，）是一种以关节软骨和骨骼破坏为特征的全身性免疫关节疾病，影响着世界上 的人口。风湿性关节炎最显著的特征是手、手腕、脚和膝盖的对称疼痛和肿胀。病理可以观察到持续
4、性滑膜炎和骨破坏，通常伴有翳形成，随疾病发展常出现关节软骨损伤和骨破坏，并显著增加了心血管疾病的发病率和病死率。目前，临床主要使用的抗风湿药物（）有：（）常规合成；（）靶向合成；（）生物合成。尽管 在治疗 过程中疗效显著，但同时伴随着严重的副作用，包括耐受性差、增加感染频率、诱导或重新激活自身免疫性疾病等。中医药治疗 在疗效确切的同时，能够运用整体观念调整机体免疫力，达到标本兼治的效果。外治方作为中医药治疗中的特殊治法，具有使用方便，费用低等特点，而且由于其作用于关节局部，经皮吸收，可进一步减轻其毒副作用。傅山风湿外治方（）出自清代名医傅山先生的大小诸证方论，方药以牛皮胶、天南星、姜汁、羌活、
5、乳香和没药 味药物组成，是治疗 的有效中药方剂，。但 中的天南星含有有毒成分，是否会对患者产生致敏或其他毒副不良影响，尚未见相关报道。本研究旨在通过动物实验验证 外敷是否会对 大鼠产生皮肤致敏作用，以及急、慢性毒副作用，从而验证 皮肤外敷给药的安全性，为其临床应用提供理论依据。材料与方法 材 料 动 物 只 级 大鼠，雌性，体质量 。由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：（京），实验动物合格证号：。本研究已通过山西中医药大学实验动物伦理委员会批准（审批号：）。动物饲养在温度恒定为 、相对湿度为 的动物房内，明暗每 循环 次。药 物 由牛皮胶、天南星、生姜汁、羌活、乳香、没
6、药按 组成，因早期牛皮胶与阿胶混用，且牛皮胶与阿胶成分相似，因此本研究中以东阿阿胶替代牛皮胶使用。阿胶购自北京同仁堂（唐山）营养保健品有限公司（生产批号：）；天南星、羌活、乳香、没药由山西中医药大学附属医院药房提供。试剂与仪器凡士林购自山东安捷高科消毒科技有限公司，生产批号：；二氯硝基苯（）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，批号：，配成 浓度备用；异氟烷：北京众实迪创科技发展有限责任公司，批号：，麻醉用；脱毛膏：利 时 洁 家 化（中 国）有 限 公 司，批 号：；橡皮胶：焦作联盟医药材料股份有限公司，批号：，无菌纱布：河南省荣贝得医疗器械有限公司，批号：，两者配合固定。谷草转氨酶（）测试
7、盒，谷丙转氨酶（）测试盒，尿素氮（）测试盒，南京建成生物工程研究所（批号：，）。酶标仪（，美国 ）、电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）、低温高速离心机（，德国）、宠物电推剪（，福州市仓山区来旺兄弟信息技术有限公司）。方 法 动物准备 级健康 雌性大鼠 只，适应饲养 后，在实验开始前 将所有大鼠背部脊柱两侧被毛剔除，首先用电推剪将被毛剪短，随后外用脱毛膏脱毛，用温水清洗干净，吹风机吹干，剃毛每侧范围 ，面积小于总面积，实验过程中每周脱毛 次。分组及干预方法将所有大鼠随机分为 组：刺激破损组（）、刺激完整组（）保持 ；过敏对照组（凡士林 ）、过敏治疗组（）、过敏阳性组（）保持 ，第 世界
8、中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.表 皮肤刺激反应评分标准红斑分值（分）水肿分值（分）无红斑无水肿轻度红斑，勉强可见轻度水肿，勉强可见中度红斑，明显可见中度水肿，明显可见（边缘高出周围皮肤）重度红斑重度水肿，皮肤隆起 ，轮廓清楚紫红色红斑并有焦痂形成严重水肿，皮肤隆起 以上，或有水泡或破溃 注：每只大鼠刺激反应评分 红斑评分 水肿评分表 皮肤过敏反应评分标准红斑分值（分）水肿分值（分）无红斑无水肿轻度红斑，勉强可见轻度水肿，勉强可见中度红斑，明显可见明显水肿，明显可见（边缘高出周围皮肤）重度红斑重度水肿，范围扩大水肿性红斑 注：每只大鼠评分 红斑评分 水肿评分、天各重复 次，第 天将给药
9、量改为凡士林 、给药 次，保持 ；急毒对照组（凡士林 ）、急毒完整组（）、急毒破损组（）每 给药 次，共 次；慢毒对照组（凡士林）、慢毒完整组（）、慢毒破损组（）给药 次，共 周。各组大鼠均将药物涂擦于大鼠背部左侧脱毛区，给药后用两层无菌纱布覆盖，并用无刺激性橡皮胶固定。所有破损组大鼠给药前用无菌注射器 号针头在脱毛区域左侧划“”，以皮肤渗血为度，每周重复 次。刺激性评价参照文献，制定皮肤刺激反应评分标准（表），观察并记录刺激破损组、刺激完整最后 次给药后肉大鼠即刻、皮肤红斑、水肿及其恢复情况；计算各组皮肤刺激平均分（平均分（红斑总分 水肿总分）动物数量），刺激指数平均分值 表示无刺激性；表示
10、轻度刺激性；表示中度刺激性；表示强度刺激性。过敏性评价参照文献，制定皮肤过敏反应评分标准（表），观察并记录过敏对照组、过敏治疗组、过敏阳性最后 次给药后大鼠即刻、皮肤红斑、水肿及其恢复情况，哮喘、站立不稳或休克等全身过敏反应情况。计算各组过敏发生率（致敏发生率 本组过敏反应动物数 本组动物总数 ），过敏率 表示弱致敏性；表示轻度致敏性；表示中度致敏性；表示重度致敏性；表示重度致敏性。急性毒性评价观察记录急毒对照组、急毒完整组、急毒破损组体重变化情况及最后 次给药后即刻（）、至第 天大鼠背部皮肤毛发、眼和黏膜的变化及其中毒情和死亡情况。慢性毒性评价观察记录慢毒对照组、慢毒完整组、慢毒破损组体质量
11、变化情况及大鼠皮肤毛发、眼和黏膜变化，以及其他中毒情况和死亡情况。给药 周后停药，每组随机数表法选取 只大鼠，腹主动脉取血后进行解剖。剩余大鼠继续饲养观察 周后腹主动脉取血并进行解剖，观察期间除不予药物，适应性喂养。大鼠腹主动脉取血后室温放置，静置，以离心半径 ，转速 离心，分离血清，采用酶联免疫吸附测定（，）检测大鼠血清中丙氨酸氨基转氨酶（，）、天冬氨酸氨基转氨酶（，）、血尿素氮（，）的含量。统计学方法采用 统计学软件对数据进行统计分析。计量资料采用均数 标准差（）表示，使用单因素 比较组间差异，然后进行 多重比较检验，以 表示差异有统计学意义。结 果 两组刺激性大鼠刺激评分比较刺激破损组、
12、刺激完整组去除受试药物后，立即观察可见两组均有个别大鼠可见皮肤微红，平均反应分值均在 区间，且在 内恢复至各组评分均为“”。结果见表。世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.表 两组刺激性大鼠刺激评分比较组 别受试药物总反应分值（分）平均反应分值（分）刺激强度刺激破损组刺激完整组 无刺激性无刺激性图 组大鼠皮肤过敏情况 组过敏性大鼠皮肤过敏性评分比较激发致敏结束后，过敏对照组、过敏治疗组大鼠均未见过敏反应，皮肤均光滑，个别大鼠去除药物即刻可见皮肤微红且在 内消失，未见红斑、水肿等皮肤刺激反应，致敏率均为；过敏阳性组所有大鼠均出现不同程度的红斑、水肿及化脓现象，并且大多有皮损出现，表现出极强
13、的致敏性，致敏率为。结果见表、图。表 组过敏性大鼠皮肤过敏性评分比较组 别致敏反应总分（分）致敏数（例）致敏率（）致敏强度过敏对照组弱致敏性过敏治疗组弱致敏性过敏阳性组极度致敏性 组急性毒性大鼠体质量比较急毒对照组、急毒完整组、急毒破损组大鼠日常行为及生理活动均未见明显异常，未出现全身中毒表现和死亡情况，解剖后未见明显组织、器官异常。组体质量均随时间稳定增长，急毒对照组第、天体质量较前 次称重明显增加（），急毒完整组第、天体质量较前 次称重明显增加（），急毒破损组第、天体质量较前 次称重明显增加（）；组大鼠同期体质量比较，差异无统计学意义（）。结果见表。组慢性毒性大鼠体质量比较慢性毒性实验过程
14、中未发生大鼠死亡情况，慢毒对照组、慢毒完整组、慢毒破损组大鼠给药区域均未见明显红斑、水肿等情况，未见全身中现象发生，且解剖后肉眼观无异常。组大鼠体质量均随时间稳定增长，给药过程中，组大鼠第、天体质量均较前 次称重明显增加（），第 天体质量明显高于第 天（），组大鼠同期组间体质量比较，差异无统计学意义（）。结果见表。慢性毒性实验中 组大鼠同期、浓度比较，差异无统计学意义（），慢毒对照组给药后与停药后血清中 浓度比较，差异有统计学意义（）；慢毒完整组、慢毒破损组大鼠给药后及停药后血清中、浓度比较，差异无统计学意义（）。除慢毒破损组给药后大鼠血清中、浓度略高于正常值，且在停药 周后恢复至正常值范围。
15、其他组大鼠血清中、浓度均在正常值范围内。结果见表。讨 论类风湿关节炎（，）是一表 组急性毒性大鼠体质量比较（，）组 别第 天第 天第 天第 天第 天急毒对照组 急毒完整组 急毒破损组 注：与本组第 天比较，；与本组第 天比较，；与本组第 天比较，；与本组第 天比较，世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.表 组慢性毒性大鼠体质量比较（，）组 别第 天第 天第 天第 天第 天第 天第 天慢毒对照组 慢毒完整组 慢毒破损组 注：与本组第 天比较，；与本组第 天比较，；与本组第 天比较，表 组大鼠给药后停药后、水平比较（）组 别时间节点（）（）（）慢毒对照组给药后 停药后 慢毒完整组给药后 停药
16、后 慢毒破损组给药后 停药后 注：慢毒对照组停药后与给药后比较，种与慢性炎症过程相关的系统性自身免疫性病变，临床主要表现为关节疼痛与活动不利，随着病情发展，可损害关节结构及周围组织，并影响关节外器官，导致包括心脏、肾脏、消化系统、神经系统等的病变。作为傅山先生的传世验方，主要用于临床外用治疗类风湿性关节炎，具有操作简易、疗效确切的优点，。该方由牛皮胶、天南星、姜汁、羌活、乳香和没药 味药物组成，方中以阿胶为君，阿胶补血滋阴，可以补充肾阴以强骨；以天南星、羌活、乳香和没药共为臣药，天南星散结消肿，羌活祛风除湿、止痛，乳香活血定痛、消肿生肌，没药散瘀定痛、消肿生肌，可以疏通经络，促进血液运行；以姜汁为佐使，姜汁熬制后性辛，温，可助本方温阳散寒之功。诸药合用能温阳散寒、舒筋活络、消肿止痛，兼顾补肾强骨，以达到治疗 的作用。现代药理研究发现：阿胶可以促进免疫细胞增殖，增强巨噬细胞吞噬功能，并通过丝裂原活化蛋白激酶（，）信号通路发挥免疫调节作用，。天南星、羌活均有良好的抗炎活性。生姜不仅能够调节机体免疫功能，还能与天南星组成药对发挥良好的镇痛抗炎效果。乳香 没药配伍在抑制 生成，降低白细胞介素（
