1、第 卷 第 期 年 月北京生物医学工程 论著基金项目：国家自然科学基金（、）资助作者单位：首都医科大学生物医学工程学院，临床生物力学应用基础研究北京市重点实验室（北京）通信作者：张海霞，教授，博士研究生导师。：角膜胶原交联后基质弹性模量与深度的定量关系曾正 李林 张海霞摘 要 目的 探索胶原交联术后 周角膜基质弹性模量与基质深度的定量关系，为交联术前个性化手术设计和术后效果评估提供理论基础。方法 选取健康 月龄新西兰白兔 只，任选 只做空白对照组，其余 只左眼行角膜交联术，为实验组，右眼作自身对照。术后 周，取眼球制作角膜基质冷冻切片，沿角膜基质深度方向选取 个 的区域进行原子力显微镜压痕实验
2、，使用 接触模型对压痕曲线进行拟合，获得弹性模量，研究角膜基质弹性模量与基质深度的定量关系。结果胶原交联术后 周，角膜基质弹性模量是其自身对照眼弹性模量的 倍。实验组相对弹性模量（）与基质深度（）的关系为 （），拟合优度为。有效的交联深度为 。结论 胶原交联术后 周角膜基质的弹性模量随基质深度仍存在指数衰减的规律。本文方法可获得角膜的有效交联深度，为相关的实验提供参考。关键词 胶原交联术；原子力显微镜；基质力学特性；模型；定量关系：中图分类号 文献标志码 文章编号（）本文著录格式 曾正，李林，张海霞 角膜胶原交联后基质弹性模量与深度的定量关系北京生物医学工程，（）：，（）：，：（：）【】，（）
3、（）（），【】；引言角膜扩张是一种伴有角膜结构进行性破坏的屈光不稳定性疾病，包括圆锥角膜、医源性角膜扩张等。它的主要特征是角膜局部区域变薄且向前突出，这会导致明显的视力障碍，严重影响患者的生活质量。角膜扩张病因至今尚未明确，研究表明角膜生物力学性能降低是其重要病因之一。目前，角 膜 胶 原 交 联 手 术（，）可提升角膜力学性能，已成为有效阻止角膜扩张的方法，且被广泛应用于临床。临床研究发现，后两周左右，可在角膜基质 处见一条分界线，分界线的位置可显示交联的有效深度，有效深度的确定可为 后效果评估和预测提供很大的帮助。若获得了 后力学特性和基质深度的定量关系，就可以尝试利用术前检查信息，如角膜
4、形态信息、患病程度等，结合核黄素（维生素）渗透和紫外光吸收规律，预估交联手术的有效交联深度，为患者定制个性化手术方案。目前，评估 后角膜基质改变的方法有多种，如非线性光学显微镜可测量交联后角膜胶原的自发光强度随基质深度的分布，获得高分辨率的光学图像。它虽然具有高分辨率、断层扫描、三维重建和荧光半定量和绝对定量等优点，但其只能测量角膜胶原纤维的长度和宽度等形态学信息。布里渊显微镜可以得到 后角膜的布里渊模量的分布热图，但目前的一些技术问题限制了它在临床中的应用，且其测量时间相对较长。原子力显微镜（，）压痕实验可以得到角膜基质弹性模量的分布，它能够获得样本表面结构的纳米级三维图像以及生物材料的力学
5、性能，近年来被广泛应用于生命科学研究领域。已有研究通过 压痕实验发现，经典 主要加强前基质力学性能，对后基质几乎没有影响。等对体外猪眼角膜行，用 获得了角膜基质的弹性模量，发现术后角膜基质的弹性模量随基质深度呈指数衰减。既往研究工作均对体外角膜行，研究了即时交联后角膜基质的力学特性。然而交联会引起角膜基质的修复与重塑，随时间推移，角膜基质弹性模量随基质深度的变化规律是否依然呈现指数衰减规律，此类研究鲜见报道。临床研究显示，交联术后 和 个月角膜的力学性质不同。因此，通过建立 动物模型，研究交联术后一定时间时角膜基质弹性模量随基质深度的变化规律，此研究结果更具临床借鉴价值。材料与方法本研究选用
6、月龄健康新西兰大耳白兔 只，为排除术后护理药物对角膜力学特性产生的影响，任选 只（眼）作为空白对照组（）；另外 只（编号为 ），左眼行 为实验眼（），右眼为自身对照组（）。术前对兔子眼部进行检查，排除眼部疾病。实验动物由首都医科大学动物部提供，实验遵循中国科学技术委员会颁发的实验动物管理条例，遵循国际眼科和视觉科学研究中动物实验的 声明。样品准备实验眼去上皮后，用浓度为 的核黄素滴眼，每 一次，每次 滴，使眼角膜在核黄素中充分浸润；之后对术眼进行紫外光照射，光束直径为，波长为，能量密度 ，照射时长为 ，照射过程中每 滴加一次核黄素，每次 滴。术后 给实验兔双眼滴妥布霉素地塞米松，每天 次，每次
7、 滴。北京生物医学工程 第 卷术后 周处死兔，立即取角膜中部约 的组织块制备角膜切片式样，切片宽度为中央角膜厚度，切片厚度为 ，制作完成后于 中保存，保存天数不超过 。实验前将切片放至室温，清洗包埋剂后进行压痕实验。原子力压痕测试 是生物力学测试领域常用的表征技术，它可以独立地表征角膜局部的力学特性。本实验用 原子力显微镜，采用标称弹性系数为 的锥形探头（压头半径为 ）对角膜基质切片进行压痕实验，实验在缓冲液中进行。为研究不同深度处角膜基质的力学特性，对每只眼球 张切片，上皮至内皮方向选取 个正方形区域（包含基质深度 范围内）进行压痕实验，如图 所示。每个区域为 的方形，区域测试点数为 个，每
8、个点的压痕深度为 ；随基质深度方向，测试区域的编号分别为、。对角膜基质上每个点的力位移曲线进行 模型拟合得到弹性模量。模型公式为：（）（）图 压痕实验示意图 式中：为力；为弹性模量；为泊松比，对于角膜泊松比为 ；为压头的半角；为位移，见图。图 探针与角膜切片接触示意 图 为基质深度确定示意。根据图（）所示，与内皮和上皮方向垂直的箭头方向即为基质深度的方向，将实验中所记录坐标图（）方块所示投影到基质深度方向上图（）圆点，计算各圆点到上皮坐标的直线距离，即为各点所在基质的深度值。由此，获得角膜基质的弹性模量与基质深度的关系。图 基质深度的确定 第 期 曾正，等：角膜胶原交联后基质弹性模量与深度的定
9、量关系纵轴表示基质深度方向（上皮至内皮方向），为测量区域。样本、和 有 块测试区域图 角膜基质 弹性模量 结果在术前和术后 周，测量得实验组兔眼角膜中央厚度分别为 和 。对实验组和自身对照组的弹性模量求平均值和标准差，分别为 （测试点 ），（测试点 ），实验组弹性模量是自身对照组弹性模量的 倍。绘制样本的弹性模量云图（图），其中 为样本 的自身对照眼弹性模量云图。由图可知，样本 的实验眼角膜基质弹性模量在接近上皮处最大，沿基质深度方向有减小的趋势，而空白对照组角膜基质弹性模量随深度变化不明显。的 块测试区域为 ，包含在 范围内，所以对本研究后续结果分析无影响。沿基质深度方向，将 行压痕测试点作
10、为一组，将 测试点的中心坐标作为其所在基质深度的坐标，通过图 所示方法计算获得样本各基质深度处的弹性模量值。为排除个体差异的影响，展示基质弹 性 模 量 随 深 度 的 变 化 规 律，以 每 个 样 本 处的弹性模量均值做为基准，将某基质深度处的弹性模量均值与基准值的比值定义为该深度处的相对弹性模量。图 给出了实验组、自身对照组和空白对照组相同基质深度处的相对弹性模量。由图 可知，实验组的相对弹性模量随基质深度呈现衰减趋势，而对照组的相对弹性模量随基质深度增加几乎没有变化。空白对照组靠近上皮的部位弹性模量较后部略大，但总体看来随基质深度增加，弹性模量变化不大。用指数模型对实验组相对弹性模量与
11、基质深度的关系进行描述，得公式 （），拟合优度为 。将实验组和自身对照组角膜基质相同深度处的弹性模量进行比较，定义比值大于等于 的深度位置为有效交联深度。计算 个样本的有效交联深度（平均值标准差）为 。图 角膜基质相对弹性模量随深度变化 讨论角膜的基质层占角膜厚度的，由扁平、同向胶原纤维束形成的薄板层平行排列构成。角北京生物医学工程 第 卷膜基质力学特性的改变与圆锥角膜等角膜扩张疾病的发生发展息息相关，可以改变基质的力学特性。受核黄素浓度和角膜对紫外光吸收的影响，对基质内交联的诱导是深度依赖的。本文利用 动物模型，研究术后 周时角膜基质弹性模量的深度依赖规律。考虑到兔角膜的较强修复能力以及兔与
12、人寿命的对比，本研究利用交联术后 周的动物模型开展研究，一定程度上考虑了术后角膜基质修复和重塑可能对其力学性质的影响，所得结果更具临床参考价值。实验中，对角膜切片进行压痕，获得的弹性模量随深度的变化更具连续性。冷冻切片的保存和操作不会改变角膜组织的力学特性，实验前在显微镜下观察也未见纤维撕裂，故排除切片原因导致的力学特性差异。本研究显示，实验组角膜基质弹性模量提升至自身对照组的 倍。此结果与前人研究结果（后兔角膜弹性模量增加了 ）一致。空白对照组的结果显示，正常兔眼角膜前基质弹性模量比后基质弹性模量略大，但无统计学意义，这表明实验眼角膜基质弹性模量的改变是由胶原交联手术导致，与术后护理药物无关
13、。实验组兔眼角膜厚度为 ，选取 厚度范围进行研究，获得了 后 周时角膜基质弹性模量随深度仍呈指数衰减的规律。对比实验组及其自身对照组角膜基质的弹性模量，给出的有效交联深度为 ，交联区域大致处于角膜的前半部分。本研究的有效交联深度也表明 处力学特性不受交联影响，所以本研究选取 处的弹性模量值作为基准是合适的。等的研究中，测得的交联深度为 。排除不同动物角膜胶原纤维本身的差异，与本文的结果基本一致。本研究基于 动物模型，在术后 周时进行力学测试，所得结果显示角膜基质随深度依然呈现指数衰减的规律，同时给出交联深度。此结果对于评估交联术后角膜力学性能评估更具实际参考价值。本研究仍然存在一定不足。由于样
14、本量较小，一定程度上会对结果造成影响。冷冻切片贴片的方向及显微镜下没有标尺，使探针移动时不能精确探针移动的方向和距离，造成主观上的偏差，进而在后期计算出现某些深度上数值的缺失。因此，对交联后角膜恢复重建的时间确定和长期规律探索还需要进行更加深入的研究。结论 后，角膜经过 周的修复，基质的弹性模量随基质深度呈指数递减的规律性变化依然存在。此方法可获得角膜的有效交联深度，为相关的实验提供参考，也可为进一步精细化力学建模积累数据，以期为个性化角膜胶原交联手术方案提供理论依据。参考文献 乔静，晏晓明 角膜扩张疾病模型的研究进展 国际眼科纵览，（）：，（）：（），（）：吴元，李晓丽，杨松霖，等 应用 对
15、圆锥角膜及亚临床期圆锥角膜生物力学特性的研究及判别标准分析 北京大学学报（医学版），（）：，（），（）：杨凯丽，顾宇伟，范棋，等 圆锥角膜快速跨上皮交联手术前后 参数的重复性及差异性 国际眼科杂志，（）：，（）：吴护平，林志荣 角膜胶原交联技术及临床应用 厦门：厦门大学出版社，：，杨磊，田磊，张海霞 角膜胶原交联术及不同交联剂的研究进展 国际眼科纵览，（）：，（）：，（）：李金晶，薛劲松，蒋沁，等 角膜胶原交联术治疗圆锥角膜的研究进展 国际眼科杂志，（）：第 期 曾正，等：角膜胶原交联后基质弹性模量与深度的定量关系，（）：，：张经，王青枝 激光共焦显微镜下圆锥角膜交联术后角膜基质的观察 临床眼科杂志，（）：，（）：，：，：，：，（）：，：，（）：，（）：陈昕妍，曾正，张海霞，等 基于原子力显微镜力曲线阵列模式获得兔角膜基质细胞弹性模量的方法研究 北京生物医学工程，（）：，（）：朱小敏，晏晓明 原子力显微镜在眼组织结构观察及生物力学测量研究中的应用 国际眼科纵览，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，：，（）：樊廷俊，胡修忠，葛源 人类角膜基质细胞研究进展 山东大学学报（医学版），（）：，（），（）：张海霞，张迪，秦晓，等 角膜生物力学特性研究进展 科技导报，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：（收稿，修回）北京生物医学工程 第 卷
