1、760安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)网络出版时间：2023-04-21 10：29：13 网络出版地址:h t t ps:/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1339.010.h t mlFTO及其抑制剂对DLBCL利妥昔单抗耐药的影响顾季炜,施梅駕宋国齐摘要 目的 探讨脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）及其抑制 剂对弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）利妥昔单抗耐药的影 响。方法 选取2种“双重打击”淋巴瘤衍生的细胞系，活 化B细胞样
2、（ABC型）OCI-LY8（LY8）和生发中心B细胞样（GCB型）OCI-LY18（LY18），采用梯度加药法构建利妥昔单 抗耐药细胞系（LY8R、LY18R）；运用CCK-8法检测不同浓度 利妥昔单抗分别干扰亲本及耐药细胞后的细胞存活率并计 算半数抑制浓度（IC50）值;An n ex in V/P I双染法检测亲本及 耐药细胞的凋亡率;RT-q RCR、免疫荧光和West er n bl o t检测 在耐药细胞株中去甲基化酶FTO的表达情况;在耐药细胞 株中加入甲氯芬酸钠（MA）抑制FTO表达，用RT-q RCR和 West er n bl o t验证抑制情况，并通过West er n b
3、l o t分析抑制耐 药株中FTO后,c-My c和CEBP A的表达情况。结果 与亲 本细胞比较，在利妥昔单抗耐药的细胞株中，去甲基化酶 FT0、c-My c表达均增加,CEBP A表达降低，差异均有统计学 意义（P 0.01）。耐药细胞株经MA处理后,FT0、c-My c表 达降低,CEBP A表达增高,差异均有统计学意义（P 0.01）。结论FT0在耐药株中表达明显增高,MA可抑制DLBCL耐 药细胞中FTO表达，可能对利妥昔单抗耐药的DLBCL患者 有治疗的潜能。关键词 弥漫大B细胞淋巴瘤;利妥昔单抗;脂肪量和肥胖 相关蛋白;c-My c中图分类号R55文献标志码A 文章编号1000-
4、1492（2023）05-0760-06 d o i:10.19405/j.c n k i.issn io o o-1492.2023.05.010弥漫大B细胞淋巴瘤（d if f u se l a r g e B c el l l y mph o ma,DLBCL）是起源于生发中心的,是非霍奇金 淋巴瘤（n o n-h o d g k in l y mph o ma,NHL）中最常见的一 种类型。利妥昔单抗联合环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松（r it u x ima b,c y c l o ph o sph a mid e,d o x o r u bic in,v in c r ist
5、 in e,a n d pr ed n iso n e,R-CHOP）方 案大约能治愈60%的DLBCL患者,其余患者则会 出现难治或复发。因此，研究利妥昔单抗获得性 2022-12-18 接收 基金项目：国家自然科学基金（编号=81770214）作者单位J南通大学医学院，南通2260012南通大学附属医院血液科，南通226001作者简介:顾季炜，女,硕士研究生；宋国齐，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者,E-ma il:sd so n g g q 163.c o m耐药的机制具有重大意义。m6A是腺昔N6位发生 甲基化，是一种转录后修饰，在癌症发生、发展及耐 药中发挥重要的作用。研究表
6、明,MYC基因易 位相关的DLBCL与R-CHOP治疗的低生存率相 关,这表明MYC可能与DLBCL利妥昔单抗耐药存 在相关性。脂肪量和肥胖相关蛋白（f a t ma ss a n d o-besit y-a sso c ia t ed pr o t ein,FTO）是一种去甲基化 酶，在急性髓系白血病（a c u t e my el o id l eu k emia,AML）中 R-2-羟基戊二酸（R-2-h y d r o x y g l u t a r a t e,R-2HG）通过靶向FTO/m6A/MYC/CEBP A信号传导，抑制了癌细胞增殖,发挥抗肿瘤作用。甲氯芬酸 钠（mec l
7、 o f en a mic a c id,MA）可结合FTO的活性表 面，选择性抑制FTO介导的m6A去甲基化,减少胶 质母细胞瘤干细胞的增殖。该研究旨在探讨 FTO及其抑制剂MA通过MYC、CEBP A影响DLBCL 利妥昔单抗的耐药机制。1材料与方法1.1试剂与仪器RP MI-1640培养基、胎牛血清（美国Gibc o公司）；健康人血浆（南通大学附属医 院健康体检者）；SDS-P AGE凝胶配制试剂盒、CCK-8 试剂盒（日本 Do jin Do 公司）；An n ex in V-FITC/P I 双 染细胞凋亡试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公 司）；利妥昔单抗注射液（上海罗氏制药有限公
8、司）；兔抗人FTO单克隆抗体（美国Sa n t a Cr u z Bio t ec hn o l o g y 公司）;兔抗人c-My c单克隆抗体、兔抗人 CEBP A单克隆抗体、兔抗人GAP DH单克隆抗体（美国Cel l Sig n a l in g Tec h n o l o g y公司）；引物由广州 市锐博生物技术有限公司设计及合成;Tr izo l试剂（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；酶联仪（美 国Bio t ek公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；蛋白 免疫印迹电泳设备及化学发光成像系统（美国BioRa d 公司）；Qu a n t St u d io 5荧光定量P CR仪（美国
9、 Th er mo f ish er 公司）。1.2方法1.2.1细胞来源与培养 选取2种“双重打击”淋 巴瘤衍生的细胞系，活化B细胞样（ABC型）0CI-LY8（LY8）和生发中心B细胞样（GCB型）0CI-安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)761LY18(LY18),均购自中国科学院细胞库上海保藏 中心。取生长状态良好的细胞系，培养于含10%胎 牛血清、1%青霉素-链霉素的RP MI-1640完全培 养基中，置于37弋、5%C()2、100%饱和湿度的培养 箱中培养，观察细胞培养基颜色及显微镜下密度,及
10、 时换液和传代。1.2.2耐药细胞株模型的建立 采用梯度加药法 诱导DLBCL细胞系的耐药，分别将处于生长对数期 的细胞系LY8、LY18以0.5 x l O/ml的密度接种 于含10%新鲜人血浆的RP MI-1640培养基中，加入 0.5 pig/ml利妥昔单抗,12 h后换正常完全培养基 培养至细胞状态恢复正常(约4 5 d)，在下个周期 将利妥昔单抗浓度提高到前1个周期的2倍，按此 方式重复9个周期后,得到对128 jig/ml利妥昔单 抗耐药的细胞株(LY8R、LY18R)。1.2.3 CCK-8法检测细胞存活率 将亲本及耐药 细胞株分别接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞5 X104个
11、，分别加入浓度为0、2、10、50、100 Mg/ml利 妥昔单抗,每个平行样本3个副孔，孵育48 h后按 所提供的实验步骤在酶联仪上测450 n m波长处的 吸光度值，计算细胞存活率。将耐药细胞株及经 MA根据药物说明书MA的半数抑制浓度(h a l f ma x ima l in h ibit o r y c o n c en t r a t io n,IC50)为 5 6 x 106 mo l/L处理后的耐药细胞株分别接种于96孔细胞 培养板中，每孔细胞5 x 104个,每个平行样本3个 副孔，孵育48 h后，按实验步骤在酶联仪上测450 n m波长处的吸光度值，计算细胞存活率。1.2.
12、4 流式细胞术检测调亡 将亲本及耐药细胞 株均分为2组：0|ig/ml和50|j,g/ml利妥昔单抗 组，每组3个复孔，于细胞培养箱内,48 h后收集细 胞，1 000 r/min 离心 5 min,P BS 洗 3 次，Bin d in g Bu f f er重悬细胞，分别加入FITC-An n ex in V和P I各5|x l,避光孵育20 min。BD流式细胞仪检测细胞凋亡 率，Fl o w jo软件进行统计分析。1.2.5 RT-q P CR 测定 FTO 表达 收集 2 x 106 3 x 106个细胞,提取总RNA,参照逆转录试剂盒说明 书合成c DNA,采用RT-q P CR检
13、测各组FTO的表达 情况，引物序列由广州锐博生物技术有限公司设计 及合成，引物序列见表1。1.2.6 West er n bl o t检测 收集亲本及耐药细胞，提取总蛋白，并进行BCA蛋白定量分析。SDS-P AGE 电泳，随后将蛋白转至P VDF膜上，转膜结束 后用5%脱脂牛奶封闭2 h。分别加入FTO抗体(1:1 000)、c-My c抗体(1:1 000)、CEBP A抗体表1 RT-qPCR引物序列引物名称序列(50)FTO-TGCC CGA ACA TTA CCT GCT GFTO-RTGC TCC TTC TAG GGT TIT GCTGAP DH-FGGT CAC CAG GGC
14、 TGC TTT TAGAP DH-RGGA TCT CGC TCC TGG AAG ATG(1:1 000)及 GAP DH 抗体(1:1 000)4 兀孵育过 夜。TBST洗膜3次，每次10 min,结束后分别加入 HRP标记的羊抗兔Ig G二抗(1:5 000)室温避光孵 育2 h,TBST洗膜5次，ECL化学发光法显影Ima g e J测量条带灰度值。1.2.7免疫荧光检测 将亲本及耐药细胞用PBS 清洗3次,4%多聚甲醛固定15 min,P BS洗3次,0.5%Tr it o n X-100 室温透化5 min,封闭 1 h,P BS 洗 3次,4七过夜孵育荧光一抗FTO,P BS洗
15、3次、室 温避光孵育荧光二抗2 h,DAP I染核5 min、滴加抗 淬灭液后拍照。1.3 统计学处理 采用Gr a ph pa d P r ism&0软件 进行统计分析，实验数据采用x s表示。组间比较 用t检验，以P 0.05为差异有统计意义。2 结果2.1利妥昔单抗耐药DLBCL细胞株鉴定 将亲 本及耐药细胞株分别重悬于RP MI-1640完全培养 基及含10%新鲜人血浆RP MI-1640培养基中，观察 细胞存活率。结果显示在0、2、10、50、100 jx g/ml的 利妥昔单抗作用下,LY8及LY8R细胞的IC50分别 为 0.54.47.15 iig/ml,耐药指数为 87.31
16、；LY18 及 LY18R 细胞的 g o分别为47.90.227.0 耐药指数为4.74,差异均有统计学意义(t=68.12、7.425,均 P 0.001)。见图 1。2.2利妥昔单抗处理亲本与耐药细胞株的凋亡差 异 与对照组(0 pt g/ml利妥昔单抗组)比较,50|x g/ml利妥昔单抗组和DLBCL耐药株(LY8R、LY18R)组细胞凋亡差异均无统计学意义,而亲本细 胞株组(LY8、LY18),差异有统计学意义(P 0.001)o 见图 2。2.3 RT-qPCR检测FTO在亲本与耐药DLBCL 细胞株中的表达情况 RT-q P CR检测结果显示,FTO在耐药细胞株中表达明显升高，表明FTO可能 与DLBCL利妥昔单抗耐药存在相关性。见图3。2.4免疫荧光检测FTO蛋白在亲本与耐药DL-BCL细胞株中的表达情况免疫荧光结果显示,FTO在耐药细胞株中表达明显升高，表明FTO可能762安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)150 LY18RLY180-1-1-1-10 2 10 50 100利妥
