1、DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2022-0659贾舒安，柴雨昕，杨寒珺，张凡凡，马春晖.麻叶荨麻青贮中优势乳酸菌的分离与鉴定.草业科学,2023,40(5):1410-1419.JIASA,CHAIYX,YANGHJ,ZHANGFF,MACH.IsolationandidentificationofdominantlacticacidbacteriafromUrticacannabinasilage.PrataculturalScience,2023,40(5):1410-1419.麻叶荨麻青贮中优势乳酸菌的分离与鉴定贾舒安1,2，柴雨昕1，杨寒珺1，张凡凡1，马
2、春晖1（1.石河子大学动物科技学院,新疆石河子832003；2.新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心,新疆乌鲁木齐830000）摘要：本研究对麻叶荨麻(Urtica cannabina)青贮饲料中优势乳酸菌进行分离鉴定，为改善麻叶荨麻青贮品质提供理论依据。经传统微生物和分子生物学鉴定，结果表明：麻叶荨麻青贮中共分离得到 11 株优势乳酸菌，其中 1 株为格氏乳球菌(Lactococcus garvieae,QM7)，1 株为粪肠球菌(Enterococcus faecalis,QM16)，1 株为鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum,QM35)，2 株为铅黄肠球菌(Ente
3、rococcus casseliflavus,QM13、QM32)，3 株为类肠膜魏斯氏菌(Weissellaparamesenteroides,QM6、QM8、QM10)，3 株为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus,QM9、QM11、QM12)。分离出的乳酸菌均能在 445 以及 3.0%和 6.5%的 NaCl 条件下良好生长；而所有菌株在 pH 为 3 时不生长，在 pH 为3.59 呈现生长或微弱生长。研究结果表明菌株 QM7 和 QM11 在培养至 24h 时 pH 可下降到 3.82 和 3.78，OD600值为2.12 和 2.06，表现出最强的产酸能力和
4、生长速率，可作为后期调控麻叶荨麻青贮的菌剂应用。关键词：麻叶荨麻；青贮；乳酸菌；分离；鉴定文献标志码：A文章编号：1001-0629(2023)05-1410-10Isolation and identification of dominant lactic acid bacteria from Urtica cannabina silageJIAShuan1,2,CHAIYuxin1,YANGHanjun1,ZHANGFanfan1,MAChunhui1(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,83200
5、0,Xinjiang,China;2.XinjiangAnimalDiseasePreventionandControlCenter,Urumqi,830000,Xinjiang,China)Abstract:WeisolatedandidentifieddominantlacticacidbacteriainUrtica cannabinasilageandprovidedatheoreticalbasisforimprovingthequalityofU.cannabinasilage.Throughtraditionalmicrobialandmolecularbiologicalide
6、ntification,11strainsofdominantlacticacidbacteriawereisolatedfromU.cannabinasilage.StrainQM7wasidentifiedasLactococcusgarvieae,QM16wasidentifiedasEnterococcus faecalis,QM35wasidentifiedasEnterococcus gallinarum,QM13andQM32 were identified as Enterococcus casseliflavus,QM6,QM8,and QM10 were identifie
7、d as Weissellaparamesenteroides,andQM9,QM11,andQM12wereidentifiedasPediococcus pentosaceus.Inaddition,theisolatedlacticacidbacteriawereculturedat445andinamediumcontaining3.0%and6.5%NaCl.NoneofthestrainsgrewatpH3.0,andgrowthorweakgrowthwasobservedatpH3.59.ThepHvaluesofstrainsQM7(L.garvieae)andQM11(P.
8、pentosaceus)decreasedto3.82and3.78after24hofculture,andtheOD600valueswere2.12and2.06,exhibitingthestrongestacidproductioncapacityandgrowthrate.Thesestrainsmaybeusefulasfungalagentsforregulatingnettlesilageinlaterstages.收稿日期：2022-08-23接受日期：2023-03-29基金项目：国家自然科学基金(32060399)；农业农村部国家现代农业产业技术体系项目(CARS-34
9、)；新疆维吾尔自治区优质饲草产业技术体系项目(2022XJSC-Z-02)第一作者：贾舒安(1987-)，男，山西临汾人，高级兽医师，博士，研究方向为饲草生产与加工、动物疫病防控与诊断。E-mail:通信作者：张凡凡(1989-)，男，新疆乌鲁木齐人，副教授，博士，研究方向为饲草生产与加工。E-mail:共同通信作者：马春晖(1966-)，男，新疆哈密人，教授，博士，研究方向为饲草生产与加工。E-mail:1410-1419草业科学第40卷第5期5/2023PRATACULTURALSCIENCEVol.40,No.5http:/Keywords:Urtica cannabina;silage
10、;lacticacidbacteria;isolation;identificationCorresponding author:ZHANGFanfanE-mail:MAChunhuiE-mail:麻叶荨麻(Urtica cannabina)是荨麻属一年或多年生草本植物，广泛生长于温带海拔 8002800m的丘陵性草原、坡地、河谷等地1；其生物产量高、抗逆性强2，不仅富含蛋白质、碳水化合物、脂肪、氨基酸等多种营养物质，且兼具抗氧化、抗菌和抗炎作用3-5，极具有开发价值。新疆地区天然草地分布的麻叶荨麻不仅能够维持生态环境稳定、改善土壤成分、促进生物多样性6；且可作为放牧家畜的重要日粮来源，其可明
11、显提高放牧家畜免疫能力、改善生产性能，从而为缓解放牧家畜饲草资源缺乏提供物质基础7。当前本地麻叶荨麻分布区多为禁牧草地，牧区自然条件和生产环境恶劣，鲜饲或调制干草均存在诸多困难，且贮藏过程营养损失大、腐败率较高，饲喂家畜风险较大。因此，合理进行发酵是提高麻叶荨麻资源利用率的有效途径。据石河子大学动物科技学院草学课题组前期研究发现，麻叶荨麻在发酵过程中存在一定问题，其在底物可溶性碳水化合物(watersolublecarbohydrates,WSC)充足的情况下直接发酵成功率极低；且接种产酸效率高的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)5105cfug1发酵后，仍未能抑制梭
12、菌(Clostridiumspp.)等有害微生物的生长，进而导致发酵失败。目前有研究证实，荨麻(Urticaspp.)中具有多种抑菌成分，对诸多革兰氏阳性和阴性菌(包括有害和有益微生物)均有明显的抑制性，其中荨麻茎叶的乙醇和甲醇提取物能够完全抑制大肠杆菌(Escherichiacoli)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的生长8；全 株 提 取 物 能 够 抑 制 枯 草 芽 孢 杆 菌(Bacillussubtilis)8.33 36.21mgmL1、植 物 乳 杆 菌(72.43mgmL1)、绿脓杆菌(3.75gmL172.43mgmL1)和大肠杆菌(7.5gmL1
13、72.43mgmL1)等多种革兰氏阳性和阴性细菌的生长9；荨麻茎秆的乙醇提取物不仅对革兰氏阳性和阴性细菌有抑制性，且对白色念珠菌(Candida albicans)等真菌也有一定抑制性10；同时对产乙酸细菌亚细亚菌属(Asaia)的致腐性有明显的抑制作用。此外，革兰氏阳性菌单细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)对荨麻叶提取物较敏感11；而革兰氏阴性菌假单胞菌(Pseudomonasspp.)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)对荨麻根提取物较敏感10。因此，问题的关键极有可能是麻叶荨麻
14、中次级代谢物干扰了外源接种乳酸菌(lacticacidbacteria,LAB)的有效繁殖；而麻叶荨麻表面附着LAB 长期伴随植物的生长，可能受到的干扰作用很小。鉴于此，本研究对麻叶荨麻自然青贮过程中优势 LAB 进行分离鉴定，探究其耐盐、耐酸、产酸和生长特性等，为后期有效调控麻叶荨麻青贮品质提供基础，同时为今后特殊植物资源的开发利用提供借鉴。1 试验材料与方法 1.1 青贮样品制备麻叶荨麻采自新疆天山中部沙湾县地区紫泥泉种羊场(4401N，8582E)，待株高长至 1.5m 左右，于 2020 年 9 月 10 日(秋季)进行人工收割，将原料短切至 12cm，称取约 2.0kg 样品快速于聚
15、乙烯厌氧袋中真空密封调制青贮(真空袋规格 23cm30cm)，共计 60 袋(每个时间点 10 袋)，室温下保存，分别在青贮过程的第 0、7、15、30、60、90 天开袋取样(每个时间点随机挑选 3 袋)，进行荨麻发酵过程中优势乳酸菌(LAB)的分离鉴定。1.2 乳酸菌的分离与纯化每袋称取 20g 荨麻青贮样品，置于锥形瓶中(盛有 180mL 灭菌生理盐水)，常温置于摇床摇动2h。将浸出液在无菌操作台中，用灭菌的生理盐水进行梯度稀释，选取 3 个合适梯度，采用平板倾注法，分别吸取 0.1mL 于无菌培养皿中，倒入适量的MRS 和M17 培养基(含有0.5%的CaCO3)摇匀，37厌氧培养 4
16、8h。而后观察颜色、形态等选择典型菌落进行革兰氏染色、油镜(奥林巴斯，BX53F2，目镜10，物镜 100)镜检。初步筛选出符合 LAB 的菌株(革兰氏阳性，呈现杆状、链球状或球状的菌株，且经氧化氢酶试验阴性)，采用四区划线法在培养基第5期贾舒安等：麻叶荨麻青贮中优势乳酸菌的分离与鉴定1411http:/上分离纯化培养若干代。纯化后的菌株于选择性液体培养基(MRS、M17)中富集，与等体积的 40%甘油混合于80 封装保存备用。1.3 乳酸菌的筛选初步挑选 MRS、M17 培养基(北京路桥集团有限公司)上具有溶钙圈的典型菌株，进行革兰氏染色、镜检、过氧化氢酶促试验，进一步筛选菌株；通过不同温度生长试验、耐酸试验和耐盐试验的比较，得到生长温度范围广、耐酸、抗盐的 LAB 菌株，再对其进行生长特性检测。1.4 乳酸菌的鉴定1.4.1 生理生化鉴定将纯化后的菌株富集培养 3 代后，用比浊法调制成细胞浓度为 108cfumL1的菌悬液，而后接种到 MRS、M17 液体培养基中(接种量为 3%)，生理生化鉴定参照凌代文和东秀珠12，以及东秀珠和蔡妙英13的方法进行。其中，不同温度生长试验分别在4
