1、 一、立一、立 项项 依依 据据(一)胃癌概述 1.胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。2.全球肿瘤发病和癌症死亡率的第二位全球肿瘤发病和癌症死亡率的第二位.3.早期胃癌多无症状或仅有轻微症状。当临床症状明显时，早期胃癌多无症状或仅有轻微症状。当临床症状明显时，病变已属晚期。病变已属晚期。4.胃癌缺乏早期特异性的肿瘤诊断标志物，现有肿瘤标志物胃癌缺乏早期特异性的肿瘤诊断标志物，现有肿瘤标志物如如CEA灵敏度仅灵敏度仅40%，使肿瘤常常发生浸润转移，使肿瘤常常发生浸润转移 5.肿瘤药物化疗、放射线手段副作用大。对患者正常细胞伤肿瘤药物化疗、放射线手段副作用大。对患者正
2、常细胞伤害较大，亟需高特异性的肿瘤药物害较大，亟需高特异性的肿瘤药物(二二)微小微小RNA 1.已有报道显示，微小RNA与胃癌的发生发展有着密切的关系。2.微小RNA分子(micro RNA,miRNA)是非编码的RNA分子(noncoding RNA,ncRNA),对真核细胞的基因表达、细胞发育分化和个体发育等多方面起调控作用。3.MicroRNA的主要功能是调节与个体生长、发育、疾病发生过程相关基因的表达,在生物发育过程中发挥着包括早期发育、细胞分化、细胞凋亡、肿瘤生成等多方面的重要作用,研究miRNA的表达,尤其对其功能研究,对探索生物进化及防治人类疾病具有重要意义。(三)胃癌组织中微小
3、RNA的表达谱 芯片分析胃癌组织中异常表芯片分析胃癌组织中异常表达的微小达的微小RNA Guo J,et al.J Gastroenterol Hepatol.2009,24(4):652-657 19种差异表达的微小种差异表达的微小RNA 12 7 miR-139-5p，miR-497和和miR-768-3p首次在非肿瘤组织中发现首次在非肿瘤组织中发现 miR-340*、miR-421和和miR-658首次在癌组织中发现高表达首次在癌组织中发现高表达 二、研究目标二、研究目标 microRNA-19a 胃癌细胞 microRNA-19a？microRNA-19a抑制剂抑制剂 本课题主要研究特
4、异性微小RNA-19a的抑制剂对胃癌细胞增殖的影响，从而为胃癌的治疗提供新的靶点。初步假设：特异性微小RNA-19a的抑制剂抑制胃癌细胞的增殖。三、研究内容三、研究内容 设计并合成微小RNA-19a的2-甲氧修饰的RNA寡核苷酸（微小RNA抑制剂），用脂质体转染到SGC-7901和MGC-803胃癌细胞，然后用实时定量逆转录-聚合酶链反应技术检测微小RNA-19a的表达情况，最后用MTT法检测胃癌细胞的增殖情况。四、可行性分析 微小RNA的抑制剂由生物公司合成并购买 细胞转染实验以及MTT法技术都已普及 实时定量-PCR基础二楼生化教研室可进行本实验 五、研究方案设计五、研究方案设计 材料 胃
5、癌细胞SGC-7901和MGC-803（购于上海生化所细胞库）DMEM培养液（4C保存）胎牛血清 RNA提取Trizol法试剂 转染Lipofectamine 2000试剂 实时定量逆转录-聚合酶链反应试剂盒 通用逆转录引物 针对微小RNA-19a而设计PCR扩增的引物 微小RNA抑制剂：抑制微小RNA-19a活性的2-甲氧修饰的RNA寡核苷酸 方法 1、细胞培养 胃癌SGC-7901和MGC-803细胞在37度、含5%CO2的培养箱中培养。DMEM培养液中含有10%小牛血清。选择对数生长期细胞用于实验。2、细胞转染 转染前1d,选择生长状态良好的细胞胃癌细胞，以3105cells/well的
6、密度接种6孔板，待细胞密度达到50%-70%后，用lipofectamine 2000转染试剂按转染试剂盒说明书转染，培养4小时后新鲜培养液。3、细胞总RNA提取及实时定量RT-PCR检测微小RNA的表达水平 用Trizol试剂提取细胞内总RNA并测定RNA浓度，逆转录成cDNA，再按说明书进行实时定量PCR，以U6作为小RNA含量的参照。PCR反应条件为：先95度15min热启动，然后按94度15s、60度30s、72度30s，共40个循环。最后通过解链曲线分析扩增产物的特异性。微小RNA的相对表达量用 方法来表示，4、MTT法检测胃癌细胞增殖情况 以1.5 104cells/well接种胃
7、癌细胞于96孔板，先观察脂质体转染试剂对照组、微小RNA抑制剂阴性对照组和空白对照组3组间细胞生长差异，在确定前2组对细胞的生长没有明显影响的情况下进行一下实验。用3个不同浓度（0.50mol/L0.7mol/L1.00mol/L）的微小RNA抑制剂转染细胞，每组设3个复孔。48h后492nm和630nm双波长下检测吸光度（A）值，每组取均值计算细胞抑制率。5、统计学处理 数据用SPSS13.0软件分析，两组间均数比较用独立样本t 检测，结果用均数标准差（Xs）表示。六、预期研究成果六、预期研究成果 特异性微小RNA-19a的抑制剂抑制了胃癌细胞当中微小RNA-19a的表达，抑制了胃癌细胞的增
8、殖。七、经费预算七、经费预算 胃癌细胞SGC-7901和MGC-803（购于上海生化所细胞库）两种试剂盒（购于生物公司）总费用约5800元 八、参考文献八、参考文献 Tony Bou Kheir,Ewa Futoma-Kazmierczak,Anders Jacobsen Anders Krogh,Linda Bardram：miR-449 inhibits cell proliferation and is down-regulated in gastric cancer Zhang Chun-zhi,Han Lei,Zhang An-ling,Fu Yan-chao,Yue Xiao,Wang Guang-xiu,Jia Zhi-fan1,Pu Pei-yu：RMeseiacrcrho arRticNleA-221 and microRNA-222 regulate gastric carcinoma cell proliferation and radioresistance by targeting PTEN 蒋振，郭俊明，肖丙秀：特异性微小RNA抑制剂对胃癌细胞增殖的影响
