1、GB/T 1 9 4 2 7-2 0 0 3.J J曰J-月 9台本标准的附录 a和附录 s为资料性附录。本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。本标准由中华全国供销合作总社归口。本标准起草单位:中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局。本标准主要起草人:庞国芳、李学民、张进杰、曹彦忠、范春林、贾光群。本标 准系首次发布的国家标准。GB/T 1 9 4 2 7-2 0 0 3蜂胶中芦丁、杨梅酮、榭皮素、灰菲醇、芹菜素、松属素、苛 因、高良姜素含量的测定方法液相色谱一 串联质谱检测法 和液相色谱一 紫外检测法范 围 本标准规定了蜂胶中芦丁、杨梅酮、懈皮素、获菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良
2、姜素含量的液相色谱一 串联质谱和液相色谱测定方法 本标准适用于蜂胶中芦丁、杨梅酮、枷皮素、茨菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素含量的测定 本标准液相色谱一 串 联质谱法的 检出限:芦丁为0.1 5 g/k g;杨酶酮为。.0 5 0 g/k g;懈皮素、高良 姜素为。.0 2 5 g/k g;茨菲醇、芹菜素、松属素、苛因为。.0 0 6 0 g/k g,液相色谱法的检出限:杨梅酮、茨菲醇、芹菜素、苛因为 0.1 0 g/k g;芦丁、懈皮素、松属素、高良姜素为。2 0 g/k g e2规范性 引用 文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注 日期的引用文件，其随后所有的
3、修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6 3 7 9 测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重现性和再现性(G B/丁6 3 7 9-1 9 8 6,n e q I S O 5 7 2 5:1 9 8 1)GB/T 6 6 8 2分析实骑富用水规格和试聆方法(GB/T 6 6 8 2-1 9 9 2,n e(i I S O 3 6 9 6:1 9 8 7)原理 甲醇溶解试样，反相液相色谱柱分离黄酮化合物，八种黄酮化合物用液相色谱一 串联质谱仪测
4、定或用 高效液相色谱 紫外 检测器测 定，外标法定量。4试荆和材料 除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T 6 6 8 2规定的一级水。4.1 甲醇:色谱纯。4.2 磷酸。4.3 甲醇+水(1+1):量取 5 0 mL甲醇与5 0 mL水混合。4.4 芦丁、杨梅酮、棚皮素、获菲醇、芹菜素、松属素、苛因和高良姜素标准物质:纯度)9 9%.4.5 芦丁、杨梅酮、榭皮素、获菲醇、芹菜素、松属素、苛因和高良姜素标准储备溶液:准确称取适量的每种标准物质(4.4)，用甲醇(4.1)配制成浓度为。.1 0 mg/m L的混合标准储备溶液。4.6 芦丁、杨梅酮、撇皮素、获菲醇、芹菜素、松属素、苛因和高
5、良姜素标准工作溶液:根据需要用甲醇(4.1)和甲醇+水(4.3)将标准储备溶液(4.5)分别稀释成适当浓度的标准工作溶液。5仪器5.1 液相色谱一 串联质谱仪:配有电喷雾离子源。5.2 高效液相色谱仪:配有紫外检测器。GB/T 1 9 4 2 7-2 0 0 35.3 温度可调超声波水浴。5.4 注射过滤器:容积为 3 MI或 5 mL，并带有。，4 5 y m过滤膜5.5 微量注射器:2 5川。6 分析步骤6.1 试样溶液的制备 称取。1 g-0.2 g试样，精确到0.0 0 1 g,置于 5 0 ml,容量瓶内，加入4 0 mL甲醇，在6 0 的超声波水浴中，振荡 4 0 mi n，待样品
6、完全溶解后，取出冷却至室温然后用甲醉定容至 5 0 mL -1 0 0 m L，摇匀。用注射过滤器将试样溶液过滤至样品瓶内，摇匀后，供液相色谱仪测定。过滤的样液取 1 MI，与1 m l,水混合后，供液相色谱一 串联质谱仪测定。6.2测定6.2，1 液相色谱条件6.2.1.1 串联质谱法 a)色谱柱:M i g h t y s i l R P-1 8 3 c m 1 5 0 m mX 4.6 m m(内径)或相当 者;b)流动相:甲醇+水(6 5-1-3 5)，用磷酸(4.2)调节流动相至p H=3;c)流速:0.3 ml-/m i n;d)进样量:2 0 p L.62.12 萦外检测法 a)
7、色谱柱:Mi g h t y s i l R P-1 8 3 I C m 1 5 0 mmX4.6 mm(内径)或相当者:b)流动相:甲醇+水 5 8+4 2)，用磷酸(4.2)调节流动相至p H=3;c)流速:0.7 MI./min;d)检测波长:2 7 0 n m;e)进样量,1 0川6.2.2 质谱条件 a)扫描方式:正离子扫描;b)检测方式:多反应检测;c)电喷雾电 压:4 0 0 0 V;d)化气压力:0.0 5 5 MP a;e)气帘气压力:0.0 6 9 MP a;f)辅助气流速:6 L/rni n;9)离子源温度:3 8 0 C;h)去簇电压:1 0 0 v;i)定性离子对、定
8、量离子对和碰撞气能量，见表 1 9 表 1 八种黄酮化合物的 定性离 子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电 压GB/T 1 9 4 2 7-2 0 0 36.2.3测定6.2.3.1 液相色谱一 串联质谱检测法测定 用芦丁、杨梅酮、懈皮素、豉菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素标准储备溶液配成的混合标准工作溶液(4.6)分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中芦丁、杨梅酮、搬皮素、茨菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，芦丁、杨梅酮、懈皮素、茨菲醇、芹菜素、松属素、苛因
9、、高良姜素的保留时间见表2。芦丁、杨梅酮、懈皮素、莎菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素的总离子流图参见附录 A中的图A.1.表 2八种黄酮化合物的参考保 留时 间黄酮化合物名称保留时间/mm芦 丁6.41杨 梅 酮7.6 6懈 皮 素1 0.09茨 菲 醉1 4.1 8芹菜素1 5.2 5松 属 素2 4.5 6苛 因2 9.9 2高 良姜 素3 6.1 96.2.3.2 液相色谱紫外检测法测定 根据试样溶液中每种黄酮化合物含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和试样溶液中每种黄酮化合物的响应值均应在仪器测定的线性范围内对标准工作溶液和试样溶液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下
10、，八种黄酮化合物出峰顺序和保留时间见表 3 表 3八种 黄酮化 合物的参考保留时间黄酮化合物名称保留时间/m i n芦 丁3.3 2 6杨梅酮4.2 2 4懈 皮 素6.3 6 7荻 菲 醇1 0.0 07芹 菜 素1 0.81 0松 属 素1 9.1 1 8苛 因2 4.0 2 2高 良姜 素3 0.3 7 7 八种黄酮化合物标准物质的液相色谱图参见附录 A中的图 A.2 0 本方法的添加回收率数据参见附录 B中的表 B.16.3 平行试验 按上述步骤。对同一试样进行平行试验测定6.4空 白试验 除不称 取试样外，均按上述分析步骤进行GB/T 1 9 4 2 7-2 0 0 37 结果计算7
11、.1 液相色谱一 串联质谱检测法 蜂胶中黄酮化合物含量利用数据处理系统计算或按式(1)计算:t.、V 1 0 0 0人=c 入 一入了气:二 丁 ，二 二-二:二:刀 1 t uu u 入 1 u vu .4 4.。(1)式 中:X试样中黄酮化合物含量，单位为克每千克(g/k g);c 从标准工作曲线得到的试样溶液中 黄酮化合物的 浓度，单位为微克每毫升伽g/m L);V 试样溶液定容体积，单位为毫升(mL);二最终试样溶液所代表的试样质量，单位为克(9)。7.2 液相色谱紫外检测法 蜂胶中黄酮化合物含量利用数据处理系统计算或按式(2)计算:h只c,XV h,X m00 01 0 0 0X 1
12、 0 0 0“。(2)式中:X 试样中黄酮化合物含量，单位为克每千克(g/k g);h 试样溶液中黄酮化合物的峰高，单位为毫米(m m);标准工作溶液中黄酮化合物的峰高，单位为毫米(m m);标准工作溶液中黄酮化合物的浓度，单位为微克每毫升(c g/mL);V 试样溶液最终定容体积，单位为毫升(m L);m 最终试样溶液所代表的试样质量，单位为克(9)。注:计 算 结 果 需 将 空 白值 扣 除。精密度 本标准精密度数据是按照G B/T 6 3 7 9 的规定确定的，其重复性和再现性的值是以9 5%的可信度来计算。8.1 液相色谱一 串联质谱检测法8.1.1 重复性 在重复性条件下，获得的两
13、次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(二)，蜂胶中芦丁、杨梅酮、懈皮素、茨菲醇、芹菜素、松属素、苛因和高良姜素测定含量及重复性方程见表4,表 4液相色谱一 串联质谱检 测法八种黄酮化 合物 含量蔽围及重复 性和再现件 古a黄 翻 化 合 物 名 称测定含量/(g/k g)重 复 性 限 r再 现 性 限 R芦 丁1.3 1 3 -1.4 0 1I g r=一7.7 0 2 6 1g m+O.2 1 7 5R-0.7 3 3 1.+1.2 5 8 2杨 梅 酮0.7 3 6-0.6 4 5I g r=-4.4 8 0 4 1g.-1.6 0 9 5R=一 1.0 0 9 3 m-0.8 4 9
14、 5懈皮素0.0 7 9-0.0 2 8I g r=0.8 7 6 2 1g-1.2 2 6 3Ig R=O.7 0 6 2 1g.-1.1 7 9 0茨 菲 醉0.4 2 1 -0.1 7 1I g r=1.0 8 0 7 1 g m一0.7 0 2 6Ig R=O.9 3 0 S lg m-0.7 3 7 5芹菜素0.4 0 3 -0.1 3 2I g r=0.6 9 1 6 1g m-1.1 2 3 3Ig R=O.7 2 4 9 1g，一0.9 6 3 9松 属 素2.0 5 6-1.0 7 5I g r=1.1 1 2 0 1 g.-O.9 0 3 8Ig R=1.0 6 6 2 1
15、g.一0.7 2 6 3苛因2.9 5 4 -1.2 3 6Ig r=O.8 2 0 O l g m-O.8 9 0 3Ig R=0.4 7 5 9 1g 二一0.6 8 7 1高 良姜 素3.5 0 4-1.1 6 3Ig r=O.4 7 4 7 1 g.一0.8 0 0 4Ig R=O.9 8 9 5 1g-0.6 7 6 1注:，为两次侧定结果的算术平均值.GB/T 1 9 4 2 7-2 0 0 3 如果两次测定值的差值超过重复性限(r)，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。8.1.2 再现性 在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R),蜂胶中芦丁、杨
16、梅酮、榭皮素、茨菲醇、芹菜素、松属素、苛因和高良姜素测定含量及再现性方程见表 4.8.2 液相色谱紫外检测法8.2.1 重复性 在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，蜂胶中芦丁、杨梅酮、榭皮素、茨菲醇、芹菜素、松属素、苛因和高良姜素含量范围及重复性方程见表5,表 5 液相色谱一 紫外检测法八种黄酮化合物含量范围及重复性和再现性方程黄酮化合物名称含量范围/(g/k g)重 复性 限 r再 现 性 限 R芦 丁0.2 0-1 0 0Ig r=0.8 5 7 5 1g.-1.0 3 5 3I g R=0.8 5 9 9 1g 二一0.9 8 9 3杨 梅 酮0.1 0-5 0Ig r=0.8 6 6 7 1g m-1.1 3 4 7R=O.0 9 6 5 m+0.0 0 9 8斟 皮 素0.2 0-1 0 0Ig r=O.8 8 4 9 1g m-0.9 5 4 1I g R=0.9 3 2 5 1g 二一0.8 4 4 2玫 菲 醉0.1 0-5 0r=0.0 5 4 8 m-0.0 8 9 3R=O.0 8 5 6 m+0.0 0 1 7芹 菜 素0.1
