1、ICs65.020.01B04中华人民共和国国家标准农业部2630号公告一5一2017转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆DAS-68416-4及其衍生品种定性PCR方法Detection of genetically modified plants and derived products-Qualitative PCR method for herbicide-tolerant soybean DAS-68416-4and its derivates2017-12-25发布2018-06-01实施中华人民共和国农业部发布农业部2630号公告-5-2017前言本标准按照GB/T1.1一20
2、09给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由农业部科技教育司归口。本标准起草单位：农业部科技发展中心、天津市农业质量标准与检测技术研究所、农业部环境保护科研监测所、中国农业科学院生物技术研究所、吉林省农业科学院、黑龙江省农业科学院。本标准主要起草人：兰青阔、宋贵文、赵新、章秋艳、宛煜嵩、王永、李亮、李飞武、温洪涛。农业部2630号公告一5-2017转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆DAS-68416-4及其衍生品种定性PCR方法1范围本标准规定了转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4转化体特异
3、性普通PCR检测方法。本标准适用于转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4及其衍生品种，以及制品中DAS-68416-4转化体成分的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用RDP心是a的本黄T本安不可少的。件。凡是不注日期的引用文其最新版本（包括所有的修改用适用文GB/T6682分析实室用水规格和试验方法农业部1485号公徵2010因植物及其产品成分检测农业部2031号2013基因植物及其产品成分检测笑和纯化农业部2031号公告192013表基因植物及其产品成分检测大高内因定性PCR方法抽相NY/T672转基因植物及其品检测通用要求3术语和定义刀农业部2032013界定的以及下
4、列术语和定义适用于本文件3.1DAS-68416转化体特异性序列event-specificuence of DAS-68416DAS-68416源插人片段端与大豆基因组的连接区序列载体T-DNA部分列包括大豆组部分序列和转化4原理NT(9根据转基因耐除真剂人豆DA5684164转化体特异性序列设计特沙物对试样进行PCR扩增。依据是否扩增获得顶期的D四片段，判断样品中是否含有DAS684194转化体成分。5试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的二级水。5.1琼脂糖。5.210g/L溴化乙锭(EB)溶液：称取1.0g溴化乙锭，溶解于100mL水中，避光保存
5、。警告一溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应藏一次性手套操作并妥善处理废弃物。注：根据需要可选择其他效果相当的核酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂。5.310mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液：在160mL水中加入80.0g氢氧化钠，溶解后，冷却至室温，再加水定容到200mL。5.4500mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)溶液(pH8.0):称取18.6g乙二胺四乙酸二钠，加入70mL水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液(5.3)直至EDTA-Na2完全溶解，用氢氧化钠溶液(5.3)调pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa(121)条件下灭菌20min.1农业部2630号
6、公告一5一20175.51mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCI)溶液(pH8.0):称取121.1g三羟甲基氨基甲烷溶解于800mL水中，用盐酸调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa(121)条件下灭菌20min。5.6TE缓冲液(pH8.0):分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(5.5)和2mL乙二胺四乙酸二钠溶液(5.4)，加水定容至1000mL。在103.4kPa(121)条件下灭菌20min。5.750TAE缓冲液：称取242.2g三羟甲基氨基甲烷(Tis),先用500mL水加热搅拌溶解后，加入100mL乙二胺四乙酸二钠溶液(5.4)，用冰乙酸
7、调pH至8.0，然后加水定容到1000mL。使用时用水稀释成1TAE。5.8加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h;称取250.0mg二甲基苯腈蓝，加10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，加30mL水溶解。混合以上3种溶液，加水定容至100mL,在4下保存。5.9DNA分子量标准：可以清楚区分100bp1000bp的DNA片段。5.10 dNTPs混合溶液：将浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP4种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。5.11 Taq DNA聚合酶、PCR扩增缓冲液及25mmol/L氯化镁(MgCl2)溶液。5.12大豆内标准
8、基因Lectin引物lec-1672F:5-GGGTGAGGATAGGGTTCTCTG-3;lec-1881R:5-GCGATCGAGTAGTGAGAGTCG-3.预期扩增片段大小为210bp。5.13DAS-68416-4转化体特异性序列引物DAS-68416-4-F:5-CCGCTACTTGCTCTTGTCGT-3:DAS-68416-4-R:5-CGGTTAGGATCCGGTGAGTA-3预期扩增片段大小为221bp(参见附录A)。5.14引物溶液：用TE缓冲液(5.6)或水分别将上述引物稀释到10umol/L。5.15石蜡油。5.16DNA提取试剂盒。5.17定性PCR试剂盒。5.18
9、PCR产物回收试剂盒。6主要仪器和设备6.1分析天平：感量0.1g和0.1mg。6.2PCR扩增仪：升降温速度1.5/s,孔间温度差异1.0。6.3电泳槽、电泳仪等电泳装置。6.4凝胶成像系统或照相系统。7分析步骤7.1抽样按NY/T672和农业部2031号公告一19一2013的规定执行。7.2试样制备按NY/T672和农业部2031号公告一19一2013的规定执行。7.3试样预处理按农业部1485号公告一4一2010的规定执行。农业部2630号公告5一20177.4DNA模板制备按农业部1485号公告一4一2010的规定执行。7.5PCR扩增7.5.1试样PCR扩增7.5.1.1大豆内标准基
10、因PCR扩增按农业部2031号公告一8一2013中7.5.1.1.1的规定执行。7.5.1.2转化体特异性序列PCR扩增7.5.1.2.1每个试样PCR扩增设置3个平行。7.5.1.2.2在PC管中按表1依次加入反应试剂配制反应体系，混匀，再加25L石蜡油（有热盖功能的PCR仪可不加)。或采用经验证后效果相当的定性PCR试剂盒配制反应体系。表1PCR检测反应体系试剂终浓度体积，LddH,O10XPCR缓冲液12.525mmol/L氯化镁溶液1.5 mmol/L1.5dNTPs混合溶液0.2 mmol/L2.010mol/LDAs-68416-4-F0.8 umol/L2.010mol/LDAS
11、-68416-4-R0.8 umol/L2.0Taq DNA聚合酶0.025U/L25mg/LDNA模板2.0 mg/L2.0总体积25.0“一”表示体积不确定，如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，根据Taq DNA聚合酶的浓度确定其体积，并相应调整ddH0的体积，使反应体系总体积达到25.0L.若采用定性PCR试剂盒，则按试剂盒的推荐用量配制反应体系，但上、下游引物用量按表1执行。7.5.1.2.3将PCR管放在离心机上，500g3000g离心10s,然后取出PCR管，放人PCR仪中。7.5.1.2.4进行PCR扩增。反应程序为：94变性5min;94变性30s,58退火30s,
12、72延伸30s,共进行35次循环；72延伸7min;10保存。7.5.1.2.5反应结束后取出PCR管，对PCR扩增产物进行电泳检测。7.5.2对照PCR扩增在试样PCR扩增的同时，应设置PCR阳性对照、PCR阴性对照和PCR空白对照。以转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4为阳性对照（转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4的质量分数为0.1%1.0%的大豆基因组DNA,或转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4转化体特异性序列与大豆基因组内标准基因相比的拷贝数分数为0.1%1.0%的DNA溶液)；以非转基因大豆基因组DNA为阴性对照；以水为空白对照。除模板外，对照PCR扩增与试样PCR扩增相同(7.5.1)。7.6PCR产物电泳检测按20g/L的质量浓度称量琼脂糖，加入1TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100L琼脂糖溶液中加人5LEB溶液或适量的其他核酸染料，混匀，稍事冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取12LPCR产物与3:L加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2V/cm5V/cm条件下电泳检测。7.7凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大
