1、中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B4 7 8 9.4 22 0 1 6食品安全国家标准食品微生物学检验 诺如病毒检验2 0 1 6-1 2-2 3发布2 0 1 7-0 6-2 3实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局发 布G B4 7 8 9.4 22 0 1 61 前 言 本标准代替S N/T1 6 3 52 0 0 5 贝类中诺沃克病毒检测方法 普通R T-P C R方法和实时荧光R T-P C R方法。本标准与S N/T1 6 3 52 0 0 5相比,主要变化如下:标准名称修改为“食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如
2、病毒检验”;标准检测范围从“贝类”扩增为“食品”;修改“操作步骤”;增加“质量控制要求”,可参见附录C;删除“普通R T-P C R方法”。G B4 7 8 9.4 22 0 1 62 食品安全国家标准食品微生物学检验 诺如病毒检验1 范围本标准规定了食品中诺如病毒(N o r o v i r u s)的实时荧光R T-P C R检测方法。本标准适用于贝类,生食蔬菜,胡萝卜、瓜、坚果等硬质表面食品,草莓、西红柿、葡萄等软质水果等食品中诺如病毒核酸的检测。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1 实时荧光P C R仪。2.2 冷冻离心机。2.3 无菌刀片或等效
3、均质器。2.4 涡旋仪。2.5 天平:感量为0.1g。2.6 振荡器。2.7 水浴锅。2.8 离心机。2.9 高压灭菌锅。2.1 0 低温冰箱:-8 0。2.1 1 微量移液器。2.1 2 p H计或精密p H试纸。2.1 3 网状过滤袋:4 0 0m L。2.1 4 无菌棉拭子。2.1 5 无菌贝类剥刀。2.1 6 橡胶垫。2.1 7 无菌剪刀。2.1 8 无菌钳子。2.1 9 无菌培养皿。2.2 0 无R N a s e玻璃容器:见E.1.2。2.2 1 无R N a s e离心管、无R N a s e移液器吸嘴、无R N a s e药匙、无R N a s e P C R薄壁管:见E.1.
4、3。3 试剂除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水均为无R N a s e超纯水:见E.2.1。3.1 G、G基因型诺如病毒的引物、探针:见A.1。3.2 过程控制病毒的引物、探针:见A.1。G B4 7 8 9.4 22 0 1 63 3.3 过程控制病毒:制备见附录C。3.4 外加扩增控制R NA:制备见附录D。3.5 T r i s/甘氨酸/牛肉膏(T G B E)缓冲液:见E.2.2。3.6 5P E G/N a C l溶液(5 0 0g/L聚乙二醇P E G80 0 0,1.5m o l/LN a C l):见E.2.3。3.7 磷酸盐缓冲液(P B S):见E.2.4。
5、3.8 氯仿/正丁醇的混合液:见E.2.5。3.9 蛋白酶K溶液:见E.2.6。3.1 0 7 5%乙醇:见E.2.7。3.1 1 T r i z o l试剂:见E.2.8。4 检验程序诺如病毒检验程序见图1。图1 诺如病毒检验程序5 操作步骤5.1 病毒提取注:样品处理一般应在4以下的环境中进行运输。实验室接到样品后应尽快进行检测,如果暂时不能检测应将样品保存在-8 0冰箱中,试验前解冻。样品处理和P C R反应应在单独的工作区域或房间进行。每个样品可设置23个平行处理。5.1.1 软质水果和生食蔬菜5.1.1.1 将2 5g软质水果或生食蔬菜切成约2.5c m2.5c m2.5c m的小块
6、(如水果或蔬菜小于该体积,可不切)。5.1.1.2 将样品小块移至带有4 0 0m L网状过滤袋的样品袋,加入4 0m LT G B E溶液(软质水果样品,G B4 7 8 9.4 22 0 1 64 需加入3 0 U A.n i g e r果胶酶,或1 1 4 0 U A.a c u l e a t u s果胶酶),加入1 0L过程控制病毒。5.1.1.3 室温,6 0次/m i n,振荡2 0m i n。酸性软质水果需在振荡过程中,每隔1 0m i n检测p H,如p H低于9.0时,使用1m o l/LN a OH调p H至9.5,每调整一次p H,延长振荡时间1 0m i n。5.1.
7、1.4 将振荡液转移至离心管,如体积较大,可使用2根离心管。1 00 0 0r/m i n,4,离心3 0m i n。取上清至干净试管或三角瓶,用1m o l/LHC l调p H至7.0。5.1.1.5 加入0.2 5倍体积5P E G/N a C l溶液,使终溶液浓度为1 0 0g/LP E G,0.3m o l/LN a C l。6 0s摇匀,4,6 0次/m i n,振荡6 0m i n。1 00 0 0r/m i n,4,离心3 0m i n,弃上清。1 00 0 0r/m i n,4,离心5m i n紧实沉淀,弃上清。5.1.1.6 5 0 0LP B S悬浮沉淀。如食品样品为生食蔬
8、菜,可直接将悬浮液转移至干净试管,测定并记录悬浮液毫升数,用于后续R NA提取。如食品样品为软质水果,将悬浮液转移至耐氯仿试管中。加入5 0 0L氯仿/丁醇混合液,涡旋混匀,室温静置5m i n。1 00 0 0r/m i n,4,离心1 5m i n,将液相部分仔细转移至干净试管,测定并记录悬浮液毫升数,用于后续R NA提取。5.1.2 硬质表面食品5.1.2.1 将无菌棉拭子使用P B S湿润后,用力擦拭食品表面(1 0 0c m2)。记录擦拭面积。将1 0L过程控制病毒添加至该棉拭子。5.1.2.2 将棉拭子浸入含4 9 0LP B S试管中,紧贴试管一侧挤压出液体。如此重复浸入和挤压3
9、 4次,确保挤压出最大量的病毒,测定并记录液体毫升数,用于后续R NA提取。硬质食品表面过于粗糙,可能会损坏棉拭子,可使用多个棉拭子。5.1.3 贝类5.1.3.1 戴上防护手套,使用无菌贝类剥刀打开至少1 0个贝类。5.1.3.2 使用无菌剪刀、手术钳或其他等效器具在胶垫上解剖出贝类软体组织中的消化腺,置于干净培养皿中。收集2.0g。5.1.3.3 使用无菌刀片或等效均质器将消化腺匀浆后,转移至离心管。加入1 0L过程控制病毒。加入2.0m L蛋白酶K溶液,混匀。5.1.3.4 使用恒温摇床或等效装置,3 7,3 2 0次/m i n,振荡6 0m i n。5.1.3.5 将试管放入水浴或等
10、效装置,6 0,1 5m i n。室温,30 0 0r/m i n,5m i n离心,将上清液转移至干净试管,测定并记录上清液m L数,用于后续R NA提取。5.2 病毒R N A提取和纯化注:病毒R NA可手工提取和纯化,也可使用商品化病毒R NA提取纯化试剂盒。提取完成后,为延长R NA保存时间可选择性加入R N a s e抑制剂。操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套,并经常更换。提取出来的R NA立即进行反应,或保存在4小于8h。如果长期储存建议-8 0保存。5.2.1 病毒裂解将病毒提取液加入离心管,加入病毒提取液等体积T r i z o l试剂,混匀,激烈振荡,室温放置5m i n,
11、加入0.2倍体积氯仿,涡旋剧烈混匀3 0 s(不能过于强烈,以免产生乳化层,也可用手颠倒混匀),1 20 0 0 r/m i n,离心5m i n,上层水相移入新离心管中,不能吸出中间层。5.2.2 病毒R N A提取离心管中加入等体积异丙醇,颠倒混匀,室温放置5m i n,1 20 0 0r/m i n,离心5m i n,弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)。G B4 7 8 9.4 22 0 1 65 5.2.3 病毒R N A纯化5.2.3.1 每次加入等体积7 5%乙醇,颠倒洗涤R NA沉淀2次。5.2.3.2 于4,1 20 0 0r/m i n,离心1
12、 0m i n,小心弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)。或小心倒去上清液,用微量加样器将其吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀,室温干燥3m i n,不能过于干燥,以免R NA不溶。5.2.3.3 加入1 6L无R N a s e超纯水,轻轻混匀,溶解管壁上的R NA,20 0 0r/m i n,离心5s,冰上保存备用。5.3 质量控制5.3.1 空白对照以无R N a s e超纯水作为空白对照(A反应孔)。5.3.2 阴性对照以不含有诺如病毒的贝类,提取R NA,作为阴性对照(B反应孔)。5.3.3 阳性对照以外加扩增控制R NA,作为阳性对照(J反
13、应孔)。5.3.4 过程控制病毒5.3.4.1 以食品中过程控制病毒R NA的提取效率表示食品中诺如病毒R NA的提取效率,作为病毒提取过程控制。5.3.4.2 将过程控制病毒按5.2步骤提取和纯化R NA。可大量提取,分装为1 0L过程控制病毒的R NA量,-8 0保存,每次检测时取出使用。5.3.4.3 将1 0L过程控制病毒的R NA进行数次1 0倍梯度稀释(DG反应孔),加入过程控制病毒引物、探针,采用与诺如病毒实时荧光R T-P C R反应相同的反应条件确定未稀释和梯度稀释过程病毒R NA的Ct值。5.3.4.4 以未稀释和梯度稀释过程控制病毒R NA的浓度l g值为X轴,以其Ct值
14、为Y轴,建立标准曲线;标准曲线r2应0.9 8。未稀释过程控制病毒R NA浓度为1,梯度稀释过程控制R NA浓度分别为1 0-1、1 0-2、1 0-3等。5.3.4.5 将含过程控制病毒食品样品R NA(C反应孔),加入过程控制病毒引物、探针,采用诺如病毒实时荧光R T-P C R反应相同的反应体系和参数,进行实时荧光R T-P C R反应,确定Ct值,代入标准曲线,计算经过病毒提取等步骤后的过程控制病毒R NA浓度。5.3.4.6 计算提取效率,提取效率=经病毒提取等步骤后的过程控制病毒R NA浓度1 0 0%,即(C反应孔)Ct值对应浓度1 0 0%。5.3.5 外加扩增控制5.3.5.
15、1 通过外加扩增控制R NA,计算扩增抑制指数,作为扩增控制。5.3.5.2 外加扩增控制R NA分别加入含过程控制病毒食品样品R NA(H反应孔)、1 0-1稀释的含过程控制病毒食品样品R NA(I反应孔)、无R N a s e超纯水(J反应孔),加入G或G型引物探针,采用附录C反应体系和参数,进行实时荧光R T-P C R反应,确定Ct值。5.3.5.3 计算扩增抑制指数,抑制指数=(含过程控制病毒食品样品R NA+外加扩增控制R NA)Ct值G B4 7 8 9.4 22 0 1 66 -(无R N a s e超纯水+外加扩增控制R NA)Ct值,即抑制指数=(H反应孔)Ct值-(J反应
16、孔)Ct值。如抑制指数2.0 0,需比较1 0倍稀释食品样品的抑制指数,即抑制指数=(I反应孔)Ct值-(J反应孔)Ct值。5.4 实时荧光R T-P C R实时荧光R T-P C R反应体系和反应参数详见附录B。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。可采用商业化实时荧光R T-P C R试剂盒。也可增加调整反应孔,实现一次反应完成G和G型诺如病毒的独立检测。将1 8.5L实时荧光R T-P C R反应体系添加至反应孔后,不同反应孔加入下述不同物质,检测G或G基因型诺如病毒。A反应孔:空白对照,加入5L无R N a s e超纯水+1.5LG或G型引物探针;B反应孔:阴性对照,加入5L阴性提取对照R NA+1.5LG或G型引物探针;C反应孔:病毒提取过程控制1,加入5L含过程控制病毒食品样品R NA+1.5L过程控制病毒引物探针;D反应孔:病毒提取过程控制2,加入5L过程控制病毒R NA+1.5L过程控制病毒引物探针;E反应孔:病毒提取过程控制3,加入5L1 0-1倍稀释过程控制病毒R NA+1.5L过程控制病毒引物探针;F反应孔:病毒提取过程控制4,加入5L
