1、中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B5 0 0 9.1 9 82 0 1 6食品安全国家标准贝类中失忆性贝类毒素的测定2 0 1 6-1 2-2 3发布2 0 1 7-0 6-2 3实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局发 布G B5 0 0 9.1 9 82 0 1 6 前 言 本标准代替G B/T5 0 0 9.1 9 82 0 0 3 贝类 记忆丧失性贝类毒素软骨藻酸的测定、S N/T1 0 7 02 0 0 2 进出口贝类中记忆丧失性贝类毒素检验方法、S N/T1 8 6 72 0 0 7 进出口贝类中软骨藻酸的检测方法 液
2、相色谱-串联质谱法、S N/T2 6 6 32 0 1 0 贝类中失忆性贝类毒素检验方法 酶联免疫吸附法。本标准与G B/T5 0 0 9.1 9 82 0 0 3相比,主要变化如下:标准名称修改为“食品安全国家标准 贝类中失忆性贝类毒素的测定”;修改了固相萃取条件;改变了流动相;增加了酶联免疫吸附法;增加了液相色谱-串联质谱法。G B5 0 0 9.1 9 82 0 1 61 食品安全国家标准贝类中失忆性贝类毒素的测定1 范围本标准规定了贝类中失忆性贝类毒素测定的酶联免疫吸附法、液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。本标准中酶联免疫吸附法适用于贝类及其制品中失忆性贝类毒素的测定,液相色谱法和液相
3、色谱-串联质谱法适用于贝类及其制品(不包括盐渍制品)中失忆性贝类毒素软骨藻酸(D A)的测定。酶联免疫吸附法2 原理本方法测定基础是竞争性酶联免疫反应,酶标板上包被有针对软骨藻酸抗体的捕捉抗体,加入抗软骨藻酸抗体、标准液或样品溶液及软骨藻酸酶标记物,游离的失忆性贝类毒素与软骨藻酸酶标记物竞争软骨藻酸抗体,同时软骨藻酸抗体与捕捉抗体连接。没有结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质和显色剂加入到微孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应终止液后使颜色由蓝转变为黄色。在4 5 0n m测量微孔溶液的吸光度值,试样中失忆性贝类毒素的含量与吸光度值成反比,按绘制的标准曲线
4、定量计算。3 试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。3.1 试剂3.1.1 甲醇(CH3OH)。3.1.2 十二水合磷酸氢二钠(N a2H P O41 2 H2O)。3.1.3 氯化钠(N a C l)。3.1.4 氯化钾(K C l)。3.1.5 磷酸二氢钾(KH2P O4)。3.1.6 吐温-2 0(C5 8H1 1 4O2 6)。3.1.7 抗D A抗体。3.1.8 牛血清白蛋白(B S A)。3.1.9 D A酶标记物。3.1.1 0 过氧化氢(H2O2)。3.1.1 1 3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB,C1 6H2 0N2)
5、。3.1.1 2 硫酸(H2S O4)。G B5 0 0 9.1 9 82 0 1 62 3.2 试剂配制3.2.1 P B S溶液(p H 7.4):分别称取磷酸二氢钾0.2 0g、十二水合磷酸氢二钠2.9 0g、氯化钠8.0 0g、氯化钾0.2 0g,加水溶解并定容至10 0 0m L。3.2.2 抗体稀释液:称取1.0gB S A,加P B S溶液(p H 7.4)溶解并定容至10 0 0m L。3.2.3 抗D A抗体工作液:抗D A抗体用抗体稀释液稀释至工作浓度。3.2.4 D A酶标记物工作液:用抗体稀释液将D A酶标记物稀释至工作浓度。3.2.5 洗脱液:吸取0.5m L吐温-2
6、 0,用P B S溶液(p H 7.4)稀释至10 0 0m L。3.2.6 硫酸溶液(6m o l/L):吸取3 1 9.2m L硫酸,缓缓加至6 0 0m L水中,并用水稀释至10 0 0m L。3.3 标准品软骨藻酸(D A,C1 5H2 1NO6,C A S号1 4 2 7 7-9 7-5)标准溶液。3.4 标准溶液配制D A标准系列工作液:准确吸取适量D A标准溶液用P B S溶液稀释并定容,配制成质量浓度分别为0n g/m L、0.5n g/m L、1.0n g/m L、2.0n g/m L、5.0n g/m L和1 0.0n g/m L的D A标准系列工作液。现用现配。3.5 材
7、料3.5.1 包被有D A捕捉抗体的微孔板。注:商业化试剂盒若评价技术参数达到本标准的要求则也适合于本标准,参见附录A。3.5.2 水相微孔滤膜:0.4 5m。4 仪器和设备4.1 酶标仪。4.2 天平:感量为0.0 1g。4.3 均质器。4.4 离心机:转速60 0 0r/m i n。5 分析步骤5.1 样品采集至少采集1 0个贝类样品,并使贝肉达2 0 0g以上。冷冻样品置于保温盒中冷冻送检,或保证其处于低温状态(01 0)送检。如为带壳样品,应开壳,去除水分后冷冻送检。5.2 试样制备5.2.1 生鲜带壳样品用清水将贝类样品外表彻底洗净,切断闭壳肌,开壳,用水淋洗内部去除泥沙及其他外来物
8、。将闭壳肌和连接在胶合部的组织分开,取出贝肉,切勿割破肉体。开壳前不要加热或用麻醉剂。收集1 0 0g贝肉置于孔径约2mm的金属筛网上,沥水5m i n,检出碎壳等杂物,将贝肉均质,备用。G B5 0 0 9.1 9 82 0 1 63 5.2.2 冷冻样品在室温下,使冷冻样品呈半冷冻状态。带壳冷冻样品,按5.2.1方法清洗、开壳、淋洗取肉,除去贝肉外部附着的冰片,抹去水分,室温缓化。将1 0 0g解冻的贝肉均质,备用。5.2.3 贝类罐头将贝类罐头内容物沥干水分,充分均质,备用。5.2.4 贝肉干制品称取1 0 0g贝肉干制品放入一定量水中浸泡2 4h4 8h(4冷藏),沥干、均质、备用。5
9、.2.5 盐渍制品用清水洗涤,流水脱盐,沥干,均质,备用。5.3 试样提取称取1 0g(精确至0.0 1g)试样,加入1 0m L水,涡旋振荡1m i n,加入2 0m L甲醇,涡旋振荡1m i n,60 0 0r/m i n离心1 0m i n,移取上清液,用0.4 5m的水相微孔滤膜过滤,得到试样提取液,用P B S溶液(p H 7.4)稀释1 0 0倍,得到试样稀释液。吸取5 0L试样稀释液进行测定。5.4 测定将已包被捕捉抗体的微孔条插入微孔架并做好标记,其中包括空白对照孔、标准液孔和样液孔,分别做平行孔。向空白对照孔加入1 5 0LP B S溶液(p H 7.4),向标准液孔加入5
10、0L失忆性贝类毒素标准系列工作液,向样液孔加入5 0L样液。向上述所有微孔中加入1 0 0L D A酶标记物工作液,轻轻混合,再加入1 0 0L D A抗体工作液,迅速充分混合1m i n,用粘胶纸封住微孔以防溶液挥发,4 孵育2h。孵育结束后,倒去孔中液体,每个微孔注入3 0 0L洗脱液冲洗,翻转微孔板,倾去孔内液体,再重复以上洗板操作2次,在吸水纸上拍干。每孔加1 5 0L过氧化氢和TMB充分混合,室温避光孵育3 0m i n。每孔加入5 0L硫酸溶液(6m o l/L)迅速混匀,终止反应,在3 0m i n内测量并记录4 5 0n m波长下的吸光度值。若试样稀释液经测定超出标准曲线的线性
11、范围,可扩大稀释倍数后重新进行测定。5.5 标准曲线的制作以失忆性贝类毒素标准系列工作液的质量浓度的以1 0为底的对数值为横坐标,以按式(1)计算的标准液的百分比吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。失忆性贝类毒素标准液(或样液)的百分比吸光度值按式(1)计算:A=S-S1S0-S11 0 0%(1)式中:A 百分比吸光度值;S 失忆性贝类毒素标准工作液或样液的平均吸光度值;S1 空白对照孔的平均吸光度值;S0 0g/L的失忆性贝类毒素标准工作液的平均吸光度值。6 分析结果的表述试样中失忆贝类毒素的含量按式(2)计算:G B5 0 0 9.1 9 82 0 1 64 X=Vfm(2)式中:X 试样中
12、失忆性贝类毒素的含量,单位为微克每克(g/g);由标准曲 线 得 到 的 试 样 待 测 液 中 失 忆 性 贝 类 毒 素 的 质 量 浓 度,单 位 为 纳 克 每 毫 升(n g/m L);V 试样提取液的体积,单位为毫升(m L);f 稀释倍数;m 试样的称样量,单位为克(g)。当测定值2 0g/g时,则报告失忆性贝类毒素含量5 0%2 0%5 0%1 0%2 0%1 0%允许的相对偏差2 0%2 5%3 0%5 0%1 9 分析结果的表述试样中软骨藻酸的含量按式(4)计算:X=Vm10 0 0(4)式中:X 试样中软骨藻酸的含量,单位为微克每克(g/g);由标准工作曲线得到的试样溶液
13、中软骨藻酸的质量浓度,单位为纳克每毫升(n g/m L);V 洗脱液的定容体积,单位为毫升(m L);m 与洗脱液相当的试样质量,单位为克(g);10 0 0 换算因子。计算结果保留三位有效数字。计算结果应扣除空白值。2 0 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的1 5%。2 1 其他本方法的检出限为0.0 0 5g/g,定量限为0.0 2g/g。G B5 0 0 9.1 9 82 0 1 61 1 附 录 A商业化试剂盒评价技术参数A.1 定量限定量限为1g/g。A.2 回收率回收率为8 5%9 0%。A.3 重现性标准品变异系数1 0%,样品变异系数1 5%。A.4 交叉反应率检测D A交叉反应率达到1 0 0%。与S T X、OA、P b T x-2 等海洋毒素没有交叉反应。G B5 0 0 9.1 9 82 0 1 61 2 附 录 B软骨藻酸标准溶液的液相色谱图 软骨藻酸标准溶液的液相色谱图见图B.1。图B.1 软骨藻酸标准溶液(0.3 g/m L)的液相色谱图G B5 0 0 9.1 9 82 0 1 61 3 附 录 C软骨藻酸标准溶液的多反应监测色谱图 软骨藻酸标准溶液的多反应监测色谱图见图C.1。图C.1 软骨藻酸标准溶液(5 0n g/m L)的多反应监测色谱图
