1、IC SB 56 5.1 5 0中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B/T 1 9 5 2 8-2 0 0 4奥尼罗非鱼亲本保存 技术规 范T e c h n i q u e s t a n d a r d i n h o l d i n g t h e p a r e n t s o f h y b r i d b e t w e e nn i l e t i l a p i a 早a n d b l u e t i l a p i a 含2 0 0 4-0 5-3 1 发布2 0 0 4-1 0-0 1 实施中 华 人民 共 和国 国 家质量 监督检 验检疫总局中 国 国 家 标
2、 准 化 管 理 委 员 会发 布G B/T 1 9 5 2 8-2 0 0 4o li青本标准的附录 A、附录B和附录C为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国水产标准化技术委员会淡水养殖分技术委员会归口本标准起草单位:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心。本标准主要起草人:吴婷婷、杨弘、李建林。G B/T 1 9 5 2 8-2 0 0 4奥尼罗非鱼亲本保存技术规范1 范 围本标准规定了奥尼罗非鱼亲本奥利亚罗非鱼(O r e o c h r o m i s a u r e a)和尼罗罗非鱼(O r e o c h r o m i sn i l o t i c u s)的来
3、源、纯种鉴别、隔离饲养、提纯复壮和建档管理技术。本标准适用于奥尼罗非鱼亲本的保存。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。N Y/T 5 0 5 4 无公害食品 尼罗罗非鱼养殖技术规范 S C 1 0 2 7 尼罗罗非鱼 S C 1 0 4 2 奥利亚罗非鱼 S C/T 1 0 4 5 奥利亚罗非鱼亲鱼 S C/T 1 0 4 6 奥尼罗非鱼制种技术要求3 亲本来
4、源3.1 奥利亚罗非鱼来源按 S C/T 1 0 4 5的规定执行。3.2 尼罗罗非鱼来源按N Y/T 5 0 5 4 的规定执行。4 亲本纯种鉴别4.1 形态学鉴别 奥利亚罗非鱼的外部形态特征应符合S C 1 0 4 2 的规定，尼罗罗非鱼的外部形态特征应符合S C 1 0 2 7的规定。42 细胞遗传学鉴别 奥利亚罗非鱼的染色体数与核型应符合 S C 1 0 4 2 的规定;尼罗罗非鱼的染色体数与核型应符合S C 1 0 2 7 的规定。4.3 生化遗传学鉴别 在血清醋酶的等电聚焦电泳图谱上，奥利亚罗非鱼具有一条等电 点为p H 4.6 9 的特异性酶带，尼罗罗非鱼具有一条等电点为p H4
5、.6 3 的特异性酶带。血清醋酶等电聚焦技术见附录A,4.4 分子遗传学鉴别4.4.1 酶切线粒体D N A标记技术 用限制性内切酶 P v u II酶切在尼罗罗非鱼 m t D NA上有 3个或 4个 P v u n位点，奥利亚罗非鱼m t D N A上有5 个P v u n 位点。酶切线粒体D N A标记技术见附录B,4.4.2 随机扩增多态性 D N A技术(简称 R A P D技术)应用R A P D技术筛选出四种引物可检测奥利亚罗非鱼或尼罗罗非鱼。引物O P Z 0 6，奥利亚罗非鱼有一条9 0 0 b p 的片段，在尼罗罗非鱼中没有。引物O P Z 1 0，尼罗罗非鱼有一条1 5
6、0 0 b p 的片段，在奥利亚罗非鱼中没有。引物O P Z 1 2，尼罗罗非鱼有一条1 7 0 0 b p 的片段，在奥利亚罗非鱼中没有。tG B/T 1 9 5 2 8-2 0 0 4引物 O P Z 1 9，尼罗罗非鱼有一条R A P D标记技术见附录 C,7 3 0 6 p 的片段，在奥利亚罗非鱼中 没有。5 隔离饲养5.1 养殖 奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼的苗种、成鱼与越冬期的养殖均按N Y/T 5 0 5 4 的规定执行。5.2 隔离措施5.2.1 制定隔离保种制度，并严格执行，定期检查。522 纯种繁殖用鱼池和供生产奥尼杂交鱼用鱼池要严格隔离。5.2.3 奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼分
7、区专池饲养，各区建立独立的进、排水系统，进、排水口安置过滤网，严防混杂。5.2.4 不同来源、不同家系、不同世代的奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼要分池隔离饲养、越冬。6 提纯复壮6.1 选育方法6.1.1 第一次筛选是在苗种培育结束时进行生长优势的个体选择，选留群体数量(总数的2/3,6.1.2 第二次筛选是鱼种培育到 1 0 0 g/尾左右的鱼种时，选留符合 S C 1 0 4 2 和 S C 1 0 2 7 的规定，表型优良、生长快的个体。6.1.3 第三次筛选是在后备亲鱼人池越冬时，选留符合S C 1 0 4 2 和S C 1 0 2 7 的规定及生长快的个体。6.1.4 第四次筛选是在翌年春
8、出越冬池时，严格按照S C 1 0 4 2,S C 1 0 2 7 和 S C/T 1 0 4 6 的规定进行，并放人产卵池繁殖。6.2 品种提纯 采用混合选择和家系选择相结合的方法。混合选择是从原品种繁殖的后代中，选出符合S C 1 0 4 2,S C 1 0 2 7 和S C/T 1 0 4 6 的规定、表型优良的个体，建立5-6 个家系，分池饲养，培育成亲鱼。对所建的每个家系留1 0 0 0 尾(雌8 0 0 尾，雄2 0 0 尾)以上的优良 个体，进行同代同血缘的同质选配，对后代进行精心培育，然后在苗种、1 0 0 g/尾鱼种时、人池越冬前、春季出池时四个阶段按选育目 标进行去劣留优。
9、如此经四个世代筛选，最后选出2 -3 个优良的家系。6.3 复壮6.3.1 选择性状良好，生长快，繁殖力强的不同家系，进行配对繁殖。子代按 5.2.3 隔离饲养。6.3.2 保留1 0 0 0 尾(雌8 0 0 尾，雄2 0 0 尾)以上的不同品种、不同家系、不同世代的亲本，以 便保持各自后代群体的杂合性，降低近交系数，防止品种退化。6.3.3 进行严格而持续的选择。7 建档管理7.1 建档 建档的原始资料一般为:引种来源、原名、原来性状、检疫、引进单位、时间、地点、数量、规格、成活率。7.2 育种记录 育种的主要记录如下:引进种的培育:鱼池面积、水源、水深、水质、放养量、投饵施肥、生长、病害
10、防治及日常管理等。繁殖:配伍、催产、孵化、出苗情况等。苗种培育:品种、面积、水源、水深、水质、放养量、饲养管理、病害防治、选育、出池、销售等情况。后备亲鱼培育:品种、面积、水源、水深、水质、放养量、饲养管理、病害防治、选育、出池、销售等 zG B/T 1 9 5 2 8-2 0 0 4 情况。7.3 选育记录 选育的主要记录为:a)第一次筛选:鱼苗至鱼种时，选留数量、平均体重(群体平均体重量)、表型性状 b)第二次筛选:鱼种至1 0 0 g 体重时，选留数量、平均体重(群体平均体重量)、表型性状。c)第三次筛选:1 0 0 g 体重至越冬时，选留数量、平均体重(群体平均体重量)、表型性状。d)
11、第四次筛选:越冬至翌年春出池时，选留数量、平均体重(群体平均体重量)、表型性状。生产中及时、准确记录、定期汇总归档，并接受监督检查。7.4 提纯复壮记录 提纯复壮的主要记录为:品种、来源、家系、世代、性状、育种(按7.2 记录)、选育(按7.3 记录)。G B/T 1 9 5 2 8-2 0 0 4 附录A (规范性附录)血清醋醉等电聚焦技术A.1 血样制备 从鱼的尾静脉抽取血液0.5 m L，室温下放置2 h，析出血清，然后以3 0 0 0 r/m i n，离心1 5 m i n，放人一2 0 冰箱保存。A.2 等电聚焦电泳 样品用重蒸水稀释 5 倍，取 1 5 k L点样。等电聚焦电泳在
12、5%聚丙烯酞胺凝胶上进行，条件为p H 4-6 两性载体电解质，电压1 5 0 0 V，电流2 5 m A，功率2 0 W，电泳2 h,A.3 染色 室温条件下，电泳凝胶在染色液中染色至出现蓝色酶带。A.4A.4.溶液配制 染色液 固蓝 R R盐 0.5 mo l/L T r i s-HC 1,p H7.1 1%,爵 乙酸茶酚 蒸馏水A.4.2 1%a-,卜 乙吸萦酚 a 一 乙酸蔡酚 R-乙酸蔡酚 丙酮 蒸馏水1 0 0 mg1 0 mL3 mL9 7-L LL mm9900.山1151匕G B/T 1 9 5 2 8-2 0 0 4 附录B (规范性附录)酶切线粒体 D N A标记技术B.
13、1 线粒体 D N A的提取 取新鲜罗非鱼肝脏约1 5 g，加5 倍体积缓冲液工，用玻璃匀浆器匀浆，匀浆液在3 0 0 0 r/m i n 离心1 5 mi n，去除细胞核及碎片。重复上述步骤一次。上清液用1 2 0 0 0 r/m i n 离心2 0 m i n，收集沉淀。再重复上述步骤两次，即得到线粒体。将沉淀充分悬浮于缓冲液R中，加两倍体积溶液工 裂解线粒体，冰浴1 0 m i n 后加1.5 倍体积溶液II 终止反应。1 0 0 0 0 r/m i n 离心3 0 m i n，取上清液用等体积饱和酚抽提两次，再用苯酚一 三氯甲烷一 异戊醇(2 5:2 4:1)抽提一次，离心后取水相，加
14、两倍体积预冷无水乙醇，在-2 0 下过夜。次日 在1 5 0 0 0 r/m i n 离心3 0 m i n，收集线粒体D N A，干燥后溶于适量的缓冲液皿中，加不含D N A酶的R N A酶,3 7 水浴 1 h以分解R N A。再用酚、酚一 三氯甲烷一 异戊醇抽提蛋白质后，沉淀、干燥，将所得线粒体 D N A溶于灭菌水中，4 保存备用。B.2 线粒体 D N A的酶解反应 按内切酶生产厂家提供的方法进行线粒体D N A酶解反应。加缓冲液W终止反应。B.3 琼脂箱凝胶电泳 凝胶浓度为1.2%-1.5%，胶中含。.5 p g/m L 澳化乙锭，电泳缓冲液为T A E，在室温下电泳，电压为1 V
15、/c m，电泳1 6 h。电泳毕在紫外灯下观察拍照。B.4 酶解片段大小的计算 以a D N A/E c o R I+H i n d IR和X D N A/H i n d D I 完全酶解片段作为分子量标准。根据 S o u t h e r n 1 9 7 9 的公式计算酶解片段大小:从凝胶上选取三个相邻的分子量标记，其分子量从大到小(或从小到大)依次为L i,L-L,，以碱基对b y 或千碱基对k b 计算，其迁移距离分别为m l,m-m z，如一个分子量为L，迁移距离为m的待测图带位于。，和m,之间，则:L 一一 K 二 -4-K,.。.(B.1)刀一刀。其中，=m a-m,(L,-L,)
16、/(L 2-L O X(m y 二m z)/(m,-m,)二 1 一 F(L,一 Li)/(L i一 L 0)X(m。一mz)l(mz 一 m,)一。B.2)K,=L:一 Lz1/(m:一m a)一1/(m:一m.).。(B.3)Kz=K,L,一 刀2,一 刀t o.(B.4)式中:L 分子量，单位为碱基对(b p)或千碱基对(k b);m 一迁移距离，单位为厘米(c m).BS 主要试荆配制缓冲液I:S E T-蔗糖缓冲液(1 0 0 m m o l/L氯化钠，1 0 m mo l/L T r i s-H C 1,0.1 m m o l/L E D T A,c s/T 1 9 5 2 8-2 0 0 42 5 0 m m o l/L 蔗糖，p H 7.8)。缓冲液II:T E-葡萄糖缓冲液(5 0 m m o l/L葡萄糖，2 5 m m o l/L T r i s-H C 1,1 0 m m o l/L E D T A,p H 8.0),缓冲液m:T E缓冲液(1 0 m m o l/L T r i s-H C 1,0.1 m m o l/L E D T A,p H 7.5),缓冲
