1、I C S 0 7.1 0 0.3 0C 5 3荡日中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B/T 1 9 9 1 5.2-2 0 0 5猪链球菌 2 型分离鉴定操作规程Me t h o d s f o r d e t e c t i o n o f S t r e p t o c o c c u s s u i s t y p e 22 0 0 5-0 9-2 7 发布2 0 0 5-1 1-0 1 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会发布GB/T 1 9 91 5.2-2 0 0 5I N青 猪链球菌 2 型是链球菌属的成员，其致病
2、菌株可致猪链球菌病，引起猪败血症、脑膜炎等。人可通过伤口感染该菌，并导致发病和死亡。建立准确、可靠的检测方法是诊断、控制和预防该菌引致的猪链球菌病的迫切要求。本标准是采用经典的细菌学鉴定方法并结合现代分子生物学技术制定的。本标准的附录 A为资料性附录，附录 B为规范性附录。本标准由国家标准化管理委员会提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准由南京农业大学、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局和中国检验检疫科学院负责起草。本标准主要起草人:陆承平、姚火春、陈国强、张敬友、张常印、唐泰山、姜众、王凯民、林祥梅、韩雪清、吴绍强、刘建、贾广乐、梅琳。本标准为首次发布。G B/T 1 9 9
3、 1 5.2-2 0 0 5猪链球菌 2型分离鉴定操作规程范围本标准规定了猪链球菌2型分离鉴定的操作方法。本标准适用于猪及其产品中猪链球菌 2 型的分离鉴定，也可用于送检菌株的鉴定。2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B/T 4 7 8 9.2 8 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2 分 析实验室用水规格和试
4、验方法 G B/T 1 9 9 1 5.3 猪链球菌 2 型 P C R定型检测技术 G B/T 1 9 9 1 5.4 猪链球菌 2 型三重 P C R检测方法 G B/T 1 9 9 1 5.5 猪链球菌 2 型多重 P C R检测方法 G B/T 1 9 9 1 5.7 猪链球菌 2 型荧光 P C R检测方法 GB/T 1 9 9 1 5.8 猪链球菌 2 型毒力因子荧光 P C R检测方法 GB/T 1 9 9 1 5.9猪锌 球菌 2型溶 血素基 因 P CR粉恻卞 洪术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 猪链球菌2型S t r e p t o c o c c u s s
5、 u i s t y p e 2 猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其英膜多糖抗原的差异，可分为 1 3 4及 1/2 共 3 5 个血清型。猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是一种重要 的人畜共患 病病原菌。操作规程4.1 方法概要 检验程序的流程示意图见附录A(资料性附录)。4.2 试荆和材料 除另有规定，所用 试剂均为分析纯，水为符合G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2 的蒸馏水。各种培养基的制备方法见附录B(规范性附录)。4.3 仪器和设备4.3.1 匀质器和匀质杯。4.3.2 天平:称量范围。g -1 0 0 0 g，读数精度。
6、.1 g,4.3.3 培养箱:3 6 士1 0C。4.3.4佰 泪 人 浴 铝 _GB/T 1 9 9 1 5.2-2 0 0 54.4 步软4.4.1 样品采集 对病猪，最急性和急性病例可无菌采集死亡猪的心、肝、肺、肾、脾脏、淋巴结等组织，慢性病例如关节炎型一般采取关节液及周围组织;对活猪可采取扁桃体拭子、鼻腔拭子.4.4.2 分离培养4.4.2.1 送检菌株的分离 划线接种于普通琼脂绵羊血平板，3 6 士1 培养 2 4 h 士2h，如菌落生长缓慢，可延长至 4 8 h 士2h，使之形成单个菌落，以供鉴定用。4.4.2.2 病料的分离和触片检查 用经火焰灭菌并冷却的接种环蘸取病料内部组织后
7、划线接种于普通琼脂绵羊血平板，于 3 6 士1 0C 培养2 4 h 士 2 h，如菌落生长缓慢，可延长至4 8 h 士2 h 后观察。同时取病料做组织触片，姬姆萨染色(按G B/T 4 7 8 9.2 8 的方法进行染色)后镜检，如见球菌 则表明病料申可能含有 链球菌。4.4.2.3 扁挑体和异腔拭子的分离 扁桃体和鼻腔拭子样品加人到含有 5 m1;灭菌的选择性 T HB增菌液(见第 B.4章)的试管中，于3 6 士1 0 C 培养 2 4 h 士2h后，划线接种于选择性普通琼脂绵羊血平板(见第B.2章)。4.4.2.4 动物产品的均质、增菌和分离 以 无菌操作取检样2 5 g，加人装有2
8、2 5 M E 灭菌选择性T H B 增菌液(见第B.4 章)的广口 瓶内，均质，于3 6 土1 0C 培养2 4 h 士2 h 后，划线接种于选择性普通琼脂绵 羊血平板(见第B.2 章)。4.4.3 初步鉴定 猪链球菌2 型在3 7 0 C 培养2 4 h 后，在普通 琼脂绵羊血平板和选择性普通琼脂绵羊血平板上形成圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明的菌落，直径约0.3 mm-1 m m，大多数菌株呈。溶血，部分菌株产生 P 溶血。将可疑菌落做革兰氏染色和过氧化氢酶试 验。本菌为革兰氏阳性球菌，菌体直径约 1 Ji m，固体培养物以双球菌为多，少量呈 3个5 个排列的短链，液体培养物
9、以链状为主，无芽抱，能形成英膜(按G B/T 4 7 8 9.2 8的方法进行染色)。本菌过氧化氢酶试验均为阴性。菌落生长特征、革兰氏染色、菌体形态和过氧化氢酶试验符合者，可初步确定为链球菌。4.4.4 生化鉴定 经初步鉴定后，做 5%乳搪、海藻糖、七叶昔、甘露醇、山梨醇、马尿酸钠等搪发醉试验。猪链球菌 2型发酵5%乳糖和海藻糖产酸，发酵七叶昔，不发酵甘露醉和山梨醉，不水解马尿酸钠。或应用法国生物一 梅里埃公司 A P 1 2 0 S t r e p 生化鉴定系统进行生化鉴定。4.4.5 玻片凝集试验 将可疑菌落接种 T HB肉汤(见第 B.3章)，于 3 6 士1 c培养 1 8 h 士2h
10、，取 1.5 mL培养物，经1 0 0 0 0 r/m i n 离心3 m i n，弃上清，用1 0 0 p L 生理盐水将沉淀悬浮，取2 5 CA L 菌体悬浮液分别和等体积的2 5 p L生理盐水、猪链球菌2 型阳 性血清作玻片 凝集试验，其中生理盐水作为稀释液对照并观察待检菌株是否有自凝现象。同时设阳性菌株对照。在生理盐水对照不凝集，阳性菌株凝集的情况下，待检菌株出现凝集为阳性反应。4.4.6 猪链球菌 2 型定型P C R检测 见G B/T 1 9 9 1 5.3,4.4.7 猪链球菌 2型毒力因子 P C R检侧 必要时进行猪链球菌 2 型毒力因子P C R检测。P C R检测方法见
11、 GB/T 1 9 9 1 5.4,GB/T 1 9 9 1 5.5,GB/T 1 9 9 1 5.7,GB/T 1 9 9 1 5.8,GB/T 1 9 9 1 5.9,5 试验结果分析判定5.1 符合以下特性者应判为猪链球菌 2 型:2GB/T 1 9 9 1 5.2-2 0 0 5 猪 链球菌2 型在3 7 培养2 4 h 后，在普通琼脂绵羊血平板和选择性普通琼脂绵羊血平板上形 成圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明的菌落，直径约 0.3 mm-1 mm，大多数菌株 呈 a 溶血，部分菌株产生0 溶血;革兰氏阳性球菌，单个、成对或成链存在，过氧化氢醉试验阴性;发酵 5%乳搪和海藻
12、糖产酸，发醉七叶昔.不发酵甘璐醉和山梨醉，不水解马尿酸钠(本试验项 目 具有不确定性，鉴定时供参考)，或法国生物 一 梅里埃 公司A P 1 2 0 S t r e p 生化鉴定系统鉴定为 猪链球菌 2 型者;与猪链球菌 2 型阳性血清玻片凝集试验阳性，猪链球苗 2 型定型 P C R检侧阳性。5.2 符合以下特性者的菌株可判定为致病性猪链球菌 2 型菌株:符合 5.1 的特性;主要毒力基因(m r p,e f,o r f 2,s l y)全部或之一P C R检测阳 性。6 废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。GB/T 1 9 9 1 5.2-2 0 0 5
13、附录A (资料性附录)猪链球菌2型检验程序动物产晶心、肝、肺等病科蔺株选择性 T H E增翻液选 择性 普通琼庸跪羊血平板单个。成对、成链的G+球贾，过舰化氮醉明性鉴定为桩球留5%乳 抽+、海旅箱+，七叶昔+、甘摇醉一、山梨醉一，马尿口 钠 一:或A P I 2 0 S tro p鉴定为2 型血清扭集 试脸 阳 性定型 P C R检 侧 阳 性猪 链 球窗 2 型主要 毒 力荃因(m r p,ef,o rl 2,s ly)全 部或之一 P C R检洲阳 性图 A.猪链球菌 2 型检验程序G B/T 1 9 9 1 5.2-2 0 0 5 附录B (规范性附录)各种培 养荃的配制方法B.1 普通
14、琼脂绵羊血平板 牛肉 膏3.0 g 蛋白脉1 0.0 g 抓化钠(Na C D 5.0 g 磷酸二氢钾(K H2 P O,)1.0 g 琼脂1 5.0 g 蒸馏水1 0 0 0 mL 脱纤维无菌绵羊血5 0 mL 除无菌绵羊血外，混匀，加热溶解，调p H至7.6 分装，1 1 5 灭菌1 5 m i n，冷却至4 5 加人5%无菌脱纤维绵羊血倾注灭菌平板。B.2 选择性普通琼脂绵羊血平板 牛肉膏3.0 9 蛋白膝1 0.0 g 抓化钠(N a C I)5.0 g 磷酸二氢钾(KH Z P 氏)1.0 g 琼脂1 5.0 g 蒸馏水1 0 0 0 m l,无菌羊血5 0 m L 叠氮钠0.4 g
15、 结晶紫0.0 0 0 4 g 亚硫酸钠0.2 g 除无菌绵羊血和结晶紫外，混匀，加热溶解，调 p H至 7.6分装，加人结晶紫(可配成适当溶液)，1 1 5 灭菌1 5 m i n，冷却至4 6 加人5%无菌脱纤维绵羊血，混匀，倾注灭菌平板。B.3 T o d d-H e w i t t 肉汤(简称 T H B)牛肉 膏5.0 g胰蛋白 脉2 0.0 g葡葡糖2.0 g碳酸钠2.59氯化钠(Na C I)2.0 g磷酸氢二钠(Na a HP O,)0.4 g;或十二水合磷酸氢二钠(N a z H P O,1 2 H2 0)1.0 g蒸馏水1 0 0 0 mL将以上各成分混合煮沸，完全溶化，冷
16、却至室温后，调p H，于1 1 5 灭菌1 0 m i n，最终p H为7.8 aB.4选择性 To d d-He w i t t 肉汤(简称选择性 THB)牛 肉膏5.0 gGB/T 1 9 9 1 5.2-2 0 0 5 胰蛋白膝2 0.0 g 葡萄搪2.0 9 碳酸钠2.5 9 氛化钠(N&C D 2.0 g 礴酸氢二钠(Na 2 HP O,)0.4 g;或十二水合磷酸氢二钠(N a x H P 0,1 2 H2 0)1.0 g 叠氮钠。.4 9 结晶紫0.0 0 0 4 g 亚硫酸钠0.2 g 燕馏水1 0 0 0 mL 将以上各成分(结晶萦除外)混合煮沸，完全溶化，冷却至室温后，调 p H，加人结晶紫(可配成适当溶液)，于 1 1 5 灭菌1 0 m i n,最终 p H为7.8.
