1、GB/T25878一2010对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)检测PCR法警告：使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1范围本标准规定了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)聚合酶链式反应(PCR)检测方法的原理、所需试剂和材料、仪器和设备、操作步骤和结果判定。本标准适用于对虾、环境生物、饵料生物和其他各种非生物样品中传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的定性检测。不适于对病毒量或感染活性的估测以及宿主感染程度的评估。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本
2、标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SC/T7202.1一2007斑节对虾杆状病毒诊断规程第1部分：压片显微镜检查法SC/T7202.2一2007斑节对虾杆状病毒诊断规程第2部分：PCR检测法3原理3.1对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒及其流行特征传染性皮下及造血组织钚死病毒(infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus,.IHHNV)
3、粒子大小为20nm22nm,是无囊膜二十面体，在氯化铯中的浮力密度为1.40g/mL,含线状单链DNA,长度为4.1kb,衣壳由4个分子质量分别为74kD、47kD、39kD、37.5kD的多肽组成。IHHNV可感染世界各地的养殖对虾，其感染细角滨对虾(Litopenaeus stylirostris).会引起急性传染病和高死亡率(90%)，稚虾受到的危害最严重。IHHNV感染凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)会引起慢性“矮小残缺综合症”(RDS),主要影响是患病对虾生长缓慢，畸形，受感染存活对虾终生带毒，通过垂直和水平传播。3.2技术原理IHHNV的聚合酶链式反应(pol
4、ymerase chain reaction,PCR)是以IHHNV的一段389个碱基(b)长度的特异性DNA序列作为模板，以与模板两端序列互补的一对特异性寡核苷酸序列作为引物，在四种脱氧核糖核苷三磷酸存在下，利用依赖DNA的DNA聚合酶的合成作用，经过数十次变性、退火和延伸的反应循环，使模板上介于两个引物之间的DNA片段得到特异性地级数扩增，再通过电泳等手段检测到被特异性扩增的片段，从而揭示徽量IHHNV DNA的存在。4试剂和材料4.1所需试剂除引物、阳性对照和阴性对照以外，按照SC/T7202.2一2007中第5章的规定。4.2100ng/L引物F:5-CGG-AAC-ACA-ACC-C
5、GA-CTT-TA-3,-20保存，4.3100ng/L引物R:5-GGC-CAA-GAC-CAA-AAT-ACG-AA-3,-20保存.4.4阳性对照为已知IHHNV阳性的组织样品的DNA模板，一20保存。GB/T25878-20104.5阴性对照为已知IHHNV阴性的组织样品的DNA模板，一20保存。4.6空白对照以无菌双蒸水为模板。5仪器和设备所需仪器设备按照SC/T7202.2一2007中第6章的规定。6操作步骤6.1反应体系的准备6.1.1PCR反应体系的准备应在洁净区完成。6.1.2PCR反应可选择25L、50L或100uL反应体系进行，6.1.3在PCR前区按表1的要求，加入除T
6、q酶以外的各项试剂，配制成无酶反应预混物。保存于一20。在临用前，根据所需的反应份数，取出无酶反应预混物，加人相应体积的Tq酶，混匀，即成完全的反应预混物。按1份/支分装到0.2 mL PCR管中。如果PCR仪不具备热盖功能，再向各管内加人50L液体石蜡。暂存于4。表1100份PCR反应预混物所需试剂组成试剂25L体系50uL体系100L体系试剂终浓度10XPCR缓冲液（无Mg2+)250L500L1000L1氯化镁(25mmol/L)200L400L800L2.0 mmol/LdNTP(10 mmol/L)100L200L400L400 umol/L100ng/L引物F754L150L300
7、L3 ng/uL100ng/L引物R75L1504L300L3 ng/uL灭菌双蒸水1725L3450L69004LTag DNA聚合酶(5U/L)254L50L100L0.05U/L100份反应总体积24504L4900L9800L注1：25L体系模板量0.5L/反应管。注2：50L体系模板量1L/反应管。注3：100uL体系模板量2L/反应管.6.2样品准备6.2.1样品的处理应在样品区完成。6.2.2样品采集的要求按SC/T7202.1一2007中附录B的规定执行。6.2.3活体或冰冻幼体、仔虾及体长在3cm以下稚虾个体样品约5mg100mg(去掉稚虾眼)。活体或冰冻的虾鳃、胃、游泳足或
8、步足样品约5mg100mg。活体或冰冻饵料生物样品约5mg100mg。池底表土样品约500mg。将上述待检样品放人灭菌1.5mL微型离心管中，应避免各样品间的交叉污染。所有非一次性使用的样品处理工具要经清洗，然后浸于新配制的有效氯含量为3.010-3的含氯消毒剂中5mi,经无PCR产物污染的自来水充分清洗，再经蒸馏水淋洗后方可用于下一个样品。6.3DNA的提取按照SC/T7202.2一2007中7.1.3的规定执行。6.4PCR扩增6.4.1在PCR前区，按照表1对各反应体系所需的模板体积要求，向各支含有1份反应预混物的PCR管内加入相应体积的各样品DNA提取液，并设阳性对照、阴性对照和空白对照。6.4.2将上述加有样品模板的PCR管带入PCR后区，置于PCR仪中按以下程序进行扩增：952
