1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准sN/T3767,ll-2014出口食品中转基因成分环介导+iH+rrg(LAMP)tdifll|fii*ffi 11 ffr),Ex MONB9034 FnaLoop-mediated isothermal amplification detection method for geneticallymodified components in food for export-Part 11:Maize MON89034201午0 13发布 14-08-01实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发 布sN/T3767。ll-2014
2、亠一一日亠刖SN/T3767出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法 共分为30部分:第1部分:通 用要求和定义;第2部分:筛 选方法;第3 部分:玉米B t-1 1 品系;第4 部分:玉米B d 7 6 品系;第5部分:玉 米GA21品系;第6 部分:玉 米M I R 1 6 2 品系;第7 部分:玉 米M I R 6 0 4 品系;第8 部分:玉 米M O N 8 1 0 品系;第9 部分:玉 米M O N 8 6 3 品系;第1 0 部分:玉 米M O N 8 8 0 1 7 品系;第1 1 部分:玉 米M O N 8 9 0 3 4 品系;第12部分:玉 米T-25品系;
3、第13部分:玉 米3272品系;第1 4 部分:玉米5 9 1 2 2 品系;第1 5 部分:大豆A 2 7 0 4 2 品系;第1 6 部分:大 豆A 5 5 4 7-1 2 7 品系;第17部分:大 豆DP356043品系;第18部分:大 豆 GT泓 32品系;第19部分:大 豆MON89788品系;第部分:水 稻Bt-63品系;第21部分:水 稻KF6品系;第22部分:水 稻KF8品系;第23部分:水 稻KMD品系;第2 4 部分:水 稻L L R I C E 6 2 品系;第2 5 部分:水 稻M 1 2 品系;第2 6 部分:水稻T 1 G 1 9 品系;第27部分:水 稻T2A1品
4、系;第2 8 部分:小麦B 7 3 6 1 品系;第29部分:甜 菜H71品系;第30部分:油 菜RT73品系。本部分为SN/T3767的第11部分。本部分按照GB/T1,109给出的规则起草。请注意本文件的某些 内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分 由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中 华人民共和 国广东 出入境检验检疫局、中华人 民共和 国汕头 出人境检验检疫局、中华人 民共和国上海出人境检验检疫局、中华人 民共和国天津 出人境检验检疫局、中国检验检疫科IsN/T3767,1=2014学研究院、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民
5、共和国珠海出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、仲恺农业工程学院、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:刘 静宇、凌莉、蔡颖、刘津、谢力、李晓虹(关阝 文杰、陈颖、曹际娟、冯家望、曾静、李志勇、高苏娟、石磊、张隽、陈源树、李婷、关丽军。出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第I1部分:玉 米MON89034品系1 范围SN/T3767的本部分规定了食筛检测方法。本部分适用于玉米及其加工本方法的定性检测低限为0.52 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用+,仅注 日期 的版本适用于本文本文件。件。凡是不注 日期的引用文件,其GB/T6682 分析实验室用水
6、GB/T19495,2 转基 因 产 品G B/T 1 9 4 9 5.3 转基 因 产 品 检 测GB/T19495.7 转基 因 产 品 检SN/T3767,22014 出 口食AMP)检测方法 第2部分:筛选方法3 防污染措施环介导等温扩增检测过程的4 抽样与制样按照G B/T 1 9 4 9 5,7 的规定执行。.5 核酸提取纯化按照G B/T 1 9 4 9 5,3 的规定执行。6 LAMP检测方法6,1 原理6.1.1 一般原理根据转基因玉米MON89034品系外源基因和玉米边界序列设计特异性 内引物和外引物各一对,特sN/T 3767.112014性的环介导等温扩增(LAMP)初
7、异性成分的定性检测。核酸提取纯和 制sN/T3767,1卜-2014异性 目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别 目标序列上的六个独立 区域,利 用Bs莎酶启动循环链置换反应,在 玉米MON89034品系特异 目标序列启动互补链合成,在 同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液 中的Mg2+结合,产 生副产物(焦 磷酸镁)形 成乳 白色沉淀,加 人显色液,即 可通过颜色变化观察判定结果。6,1.2 显色液显色原理SYBR Green I是一种高灵敏的DNA荧光染料,可 以嵌人方式结合到双链DNA的小沟 内。当它与双链
8、DNA结合时,荧 光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时,SYBR染料分子的荧光信号不发生改变,颜 色显现为橙色;当 发生扩增反应时,随 着双链DNA的增加,SYBR染料 的荧光信号也随之大幅度增强,其 信号强度可代表双链DNA分子的数量,同 时颜色 由橙色变为绿色。6,2 仪器和设备6,2.1 超纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板:6 3.0 0,5 和8 0.0 o,5。6.2.3 离心管:0,1 m L、1,5 m L。6.2 4 移液 器:量程0.5 u L 1 0 u L;量程1 0 u L 1 0 0 u L;量程1 0 0 u L 1 0 0 0 u L。6
9、,2,5 计时器。6,3 试剂和材料除另有规定外,所 有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应 符合GB/T6682中一级水的规格。6.3,2 d N T P s 溶液:每 种核苷酸浓度1 0 m m o l/L。6,3,3 B s 莎 D N A 聚合酶(如:N E B 公司或具有同等效果的D N A 聚合酶):酶浓度8 U/u L。6,3,4 1 0 T h e r m o l P d 缓冲液:含0 m m o V L T r i s H(p H 值8.8)、1 0 0 m m d/L 硫酸铵、1 0 0 m m o l/L氯化钾、2 0 m m o l/L 硫酸镁、1%T t
10、 o n 1 0 0。6,3.5 硫酸镁溶液:5 0 m m o l/L。6.3.6 甜菜碱:5 m o l/L。6.3.7 显色液:S Y B R G r e m I 荧光染料,1 0 0 0。6.3,8 引物:根 据转基因玉米MON89034品系外源基 因和玉米边界序列设计一套特异性引物,包 括外引物1,外引物2,内引物1和内引物2。外引物扩增片段长度:245bp夕 卜 引 物1(F3,5-3):TTGCTTTCGCCTATAAATACG夕 卜 引 物2(B3,5-3):GAAACTTTGGGTTGAAATGAAAT内 弓u吻1(FIP,5,-3):GTAGATGTCCGCAGCGTTAT
11、TATAAACGGATCGTAATTTGTCGT内 引 0勿2(BIP,5-3):ATTGACCATCATACTCATTGCATCCCCAATACTCAAAAAATAACACGG6,4 实验步骤6,4.1 阴性对照、阳性对照和 空 白对照的设置6.4.1.1 阴性对 照:采用不含有待测基 因序列 的植物基 因组DNA为模板。6.4.1.2 阳性对照:2sN/T3767.1-2014采用含有 目标基因序列的植物DNA或质粒DNA作为模板,浓 度应略高于方法检测低限。6.4,1.3 设两个空 白对照:提取DNA时设置的提取空 白对照(以水代替样品);LAMP反应的空 白对照(以 DNA溶解液代替D
12、NA模板)。6.4,2 内源基因检测LAMP检测前应先进行 内源基因检测,结 果 阳性则表 明从样 品中提取 的DNA可以进行外源基 因检测;否 则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767.214的规定进行。6.4,3 玉米MON89034品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中,不 要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后,将 1uL显色液滴在管盖 内侧,盖 管盖时应小心,防 止显色液混合进人反应液中。表1 玉米MoN89034品系LAMP反应体系6.4,4 LAMP反应参数6 3.0 o,5 恒温扩增9
13、0 m i n,8 0.0 0.5 5 m i n 使酶灭活,反应结束。6,4.5 显色反应反应结束后,将 显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀,立 即在黑色背景下进行颜色观察。6,5 质量控制6.5,1 基本原则:实 验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合 以下情况。否则,任一种对照如果出现非下述正常结果,应 重做实验。6,5.2 空白对照:反 应管中液体呈橙色。6.5,3 阴性对照:反 应管中液体呈橙色。6.5.4 阳性对照:反 应管中液体呈绿色。组 分工作液浓度加样量/uL反应体系终浓度T h e r m P l 缓冲液1夕 卜 引钐 91(F310umo1/L0,2umol/L夕 卜 引
14、钐 歹2(B3)1 0 u m l/Lo.5o,2 u m o l/L内引物1(FIP)40uml/L1.6uml/L内引物2(BIP)4 0 u m l/L1.6 u m l/LdNTPs1 0 m m o l/L1.4mml/L甜荚碱5mol/L0,8ml/L硫酸镁1 5 0 m m o l/L16mmol/LBs莎DNA聚合酶8U/uL10,32U/uLDNA模板100ng/lLB ns/pL水补足至 25,0sN/T3767.1-20147 结 果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管中液体均呈橙色,同 时各种实验对照结果正常,可 判断该样 品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平
15、行样反应管中液体至少1管呈绿色,同 时各种实验对照结果正常,可 判断该样 品转基因玉米MON89034品系初筛阳性,还 应通过下列方法之一进行确证(见 附录A):按照欧盟的方法(CRLVL06/06P)进行实时荧光PCR检测;可对外引物PCR扩增产物进行序列测定。8 结 果表述8,1 检测结果为阴性,表 述为“该8.2 检测 结 果 为 转 基 因 玉 米M O N 8 9 0 3 4 品系甥实验情况进行结果判断和表述。sN/T3767.1-2014附 录 A(资 料性 附录)转基 因玉米MoN89034品系基 因序列A。1 转基 因玉米MON89034品系外源基 因和玉米边界序 列TTGCT
16、TTCGCCTATAAATACGAcGGATCGTAATTTGTcGTTTATCAAATGTACTTTCATTTTATAATAACGCTGcGGAAAAAATTGGTAATACTCTTTCTTTTTCTCCATATTGACcAAATTATGTTTTTTTAAAAACACGGTATTATAGATAAGTTTCA.2 引物 碱 基 序 列 及 构 成AATTTCATTTCAACCCAAF3:TTGCTTTCGCCTATAB3:GAAACTTTGGGTTGAFIP:GTAGATGTCCGCAAATTTGTCGTB2BIP:ATTGACCATCATACTcAAAAAATAACACGG寸冖0l亠冖卜zHTs中华人民共和国出人境检验检疫行 业 标 准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第ll部分:玉 米MoN89034品系sN/T3767,1-2014中 国 标 准 出 版 社 出 版北京 市 朝 阳区和平 里西街 甲2号(100029)北 京市西 城 区三里 河 北街16号(100045)总编室:(010)68533533网址w w w。s p C,n e t,c n中 国标
