1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准sN/T3767.1s-z014出口食品中转基因成分环介导+tf,+rrg(LAMP)toil|friEffi 15*llr|:tg a2704-12 ffieLoop-mediated isothermal amplification detection method for geneticallymodified components in food for export-Part 15Soybean A2704-122014-0卜13发布 14-08-01实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发布sN/T3767,15-201
2、4亠一一日亠刚SN/T3767出口食 品中转基 因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法 共分为30部分:第1部分:通 用要求和定义;第2部分:筛 选方法;第3部分:玉 米Bl-11品系;第4 部分:玉米B t 1 7 6 品系;第5 部分:玉米G A 2 1 品系;第6 部分:玉米M I R 1 6 2 品系;第7 部分:玉米M I R 6 0 4 品系;第8 部分:玉米M O N 8 1 0 品系;第9 部分:玉米M O N 8 6 3 品系;第1 0 部分:玉米M O N 8 8 0 1 7 品系;第1 1 部分:玉米M O N 8 9 0 3 4 品系;第1 2 部分:玉米T 2 5
3、品系;第13部分:玉 米3272品系;第1 4 部分:玉米5 9 1 2 2 品系;第1 5 部分:大 豆A?7 0 4 1 2 品系;、第1 6 部分:大豆A 5 5 4 7 1 2 7 品系;第1 7 部分:大豆D P 3 5 6 0 4 3 品系;第1 8 部分:大豆G T 泓 3 2 品系;第1 9 部分:大豆M O N 8 9 7 8 8 品系;第20部分:水 稻Bt63品系;第21部分:水 稻KF6品系;第22部分:水 稻KF8品系;第23部分:水 稻KMD品系;第24部分:水 稻LLRICE62品系;第2 5 部分:水 稻M 1 2 品系;第2 6 部分:水稻T 1 G 1 9
4、品系;第2 7 部分:水 稻T 2 A-1 品系;第2 8 部分:小麦B 7 3 6 1 品系;第29部分:甜 菜H71品系;第30部分:油 菜RT73品系。本部分为SN/T3767的第15部分。本部分按照GB/T1,109给出的规则起草。请注意本文件的某些 内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分 由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中 华人 民共和国福建 出人境检验检疫局、中华人 民共 和国广东 出人境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:邵 碧英、陈文炳、高东微、李志勇、常彦磊、凌莉、刘津、郑晶、陈彬、缪婷玉、彭娟。sN/T
5、3767,15-2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第15部分:大 豆 A2704-12品系1 范围SN/T3767的本部分规定了大豆及其制品中转基 因大豆 A270412品系特异性的环介导等温扩增(LAMP)初筛检测方法。本部分适用于大豆及其制品本方法的定性检测低限为0。2 规范性引用文件定性检测。下列文件对于本文件的应用是日期 的引用文件,仅 注 日期 的版本适用于本文件。凡是不注 日期的引用文件,本文件。GB/T6682 分析实验室用GB/T19495,2 转基 因产 品G B/T 1 9 4 9 5,3 转基 因 产G B/T 1 9 4 9 5.7 转基 因
6、 产 品 检 测抽样和制样方SN/T2668 转基因植物品系特测 方SN/T3767.214 出口食因(LAMP)检测方法 第2部分:筛选方法转基因植物及其产品成分1485号公告-7-10)3 防污染措施环介导等温扩增检测过程4 抽样与制样草生品种定性PCR方法(农 业部按照G B/T 1 9 4 9 5,7 的规定执行。5 核酸提取纯化按照G B/T 1 9 4 9 5,3 的规定执行。6 LAMP检测方法6,1 原理6.1,1 一般原 理根据转基 因大豆 A270412品系外 源基 因和大 豆边 界序列 设计 特 异性 内引 物、外 引物 和环 引物各sN/T3767.15-2014一对,
7、特 异性 目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别 目标序列上的六个独立区域,利 用Bs莎DNA聚合酶启动循环链置换反应,在 大豆A270412品系特异 目标序列启动互补链合成,在 同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液 中的Mg2+结合,产 生副产物(焦 磷酸镁)形 成乳 白色沉淀,加 人显色液,即 可通过颜色变化观察判定结果。6,1,2 显色液显色原理SYBR Green I是一种高灵敏的DNA荧光染料,可 以嵌人方式结合到双链DNA的 小沟 内。当它与双链DNA结合时,荧 光信号是游离状态的8001000倍。在
8、不发生扩增反应时,SYBR染料分子 的荧光信号不发生改变,颜 色显现为橙色;当 发生扩增反应时,随 着双链DNA的增加,SYBR染料 的荧光信号也随之大幅度增强,其 信号强度可代表双链DNA分子的数量,同 时颜色由橙色变为绿色。6,2 仪器和设备6,2,1 超纯水发生器。6.2,2 水浴锅或加热模板:6 3,0 0,5 和8 0,0 0,5。6,2.3离心管:0.1mL、1.5mL。6,2,4 移液器:量 程0,5 u L 1 0 u L;量 程1 0 u L 1 0 0 u L;量 程1 0 0 u L 1 0 0 0 u L。6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外,所 有试剂均
9、为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合G B/T 6 6 8 2 中一级水的规格。6,3,2 d N T P s 溶液:每种核苷酸浓度1 0 m m 1/L。6,3,3 Bs莎DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U/uL。6,3.4 10TllermolPol缓冲液:含0mmol/L Tris H(pH值为8,8)、100mmol/L硫酸铵、100mmol/L氯化钾、mm。1/L硫酸镁、1%Tritol100。6.3,5 硫酸镁溶液:150mmo1/L。6.3.6 甜菜碱:5m。l/L。6,3,7 显 色液:SYBR Green I荧光染料,1000。
10、6.3.8 引物:根 据转基 因大豆A270412品系外源基 因和水稻边界序列设计一套特异性引物,包 括外引物1、外引物2、内引物1、内引物2、环引物1和环引物2。外引物扩增片段长度:266bp夕 卜 引 物1(F3,53):GACACATCTCATTGCACTGA夕 卜 引 l/J2(B3,5-3):CGAGTTCTGTTAGGTCCTCTA内 引 物1(FIP,5-3):TGGCGTAATAGCGAAGAGGCGTGAGTTATTTATCAGCCAAGC内 弓u吻2(BIP,5,-3):GGATGTGCTGCAAGGCGATTTACAACGTCGTGACTGG环 引 物1(FLP,53):
11、CCGCACCGACATAAGAAGA环引物2(BLP,5-3):AAGTTGGGTAACGCCAGG6.4 实验步骤6.4.1 阴性对 照、阳性对 照和 空 白对 照 的设置6.4.1,1 阴性对 照:2sN/T3767.15-2014采用不含有 目标基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4.1,2 阳性对照:采用含有 目标基因序列的植物DNA或质粒DNA为模板,浓 度应略高于方法检测低限。6,4.1.3 设两个空 白对照:提取DNA时设置的提取空 白对照(以 水代替样品);LAMP反应的空 白对照(以 DNA溶解液代替DNA模板)。6,4,2 内源基因检测LAMP检测前应先进行 内源基因检
12、测,结 果 阳性则表明从样 品中提取 的DNA可以进行外源基 因检测;否 则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照 SN/T3767.214的规定进行 6,4.3 LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加人反应液中,不 要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后,将 1uL显色液滴在管盖 内侧,盖 管盖时应小心,防 止显色液混合进人反应液 中。表1 大 豆 A2704丬2品系LAMP反应体系6.4.4 LAMP反应参数6 3,0 o,5 恒温扩增6 0 m i n,8 0.0 0,5 5 m i n 使酶灭活,反应结束。6,4,5 显色反
13、应反应结束后,将 显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀,立 即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实 验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合 以下情况。否则,任一种对照如果组 分工作液浓度力 样量/uL反应体系终浓度T h e r m o P o l 缓冲液1夕 卜 引钐 91(F3)10umol/L0.2 u m o l/L夕 卜 引肜 92(B3)1 0 u m o l/I 0.2 u m o l/L环 引 物1(FLP)40umol/L0.8 u m 1/L环引+/J2(BLP)茌 0uml/L0,8uml/L内引物1(FIP)40uml/L1,6lmol/L内
14、引物2(BIP)40 pnol/L1,6umol/LdNTPs10mmol/L1,6mmol/L甜菜碱5mol/L1.2mml/L硫酸镁150mmol/L6,0mmol/LBs砂DNA聚合酶8U/uLo,32U/uLDNA模板100 ng/pL8.0 ng/pL水补 足 至 孔。0sN/T3767,152014出现非下述正常结果,应 重做实验。6.5,2 空白对照:反 应管 中液体呈橙色。6,5,3 阴性对照:反 应管中液体呈橙色。6.5.4 阳性对照:反 应管中液体呈绿色。7 结 果判断和确证7,1 待检样品2个平行样反应管中液体均呈橙色,同 时各种实验对照结果正常,可 判断该样 品检测结果
15、为阴性。7,2 待检样 品2个平行样反应验对照结果正常,可 判断该样 品(见 附录A):转基因大豆A27042品系初筛按照S N/T 2 6 6 8 进行按照农业部1485号公对外引物PCR扩增产物进行序列测8 结 果表述8,1 检测结果为阴性,表 述为“82 检测结果为转基 因大豆 A表述。确证实验情况进行结果判 断和sN/T3767,152014附 录 A(资 料性 附录)转基 因大 豆 A2704-12品系 目标基 因序 列及LAMP引物A,1 转基 因大 豆 A2704-12品系外源基 因和大 豆边界序 列1GACACATCTCATTGCACTGATCGGGGGCGTTCGTAGTGA
16、CTGAGGGGGTCAAAGACCAAG61AAGTGAGTTA TT冂D今fCATCGGTGCGG GCCTCTTCGC121181241FIP:BIP:A,2 LAMP引物碱基序 列及构 成F3:GACACATCTCATTGCACTGB3:CGAGTTCTGTTAGGTCCTCFLP:CCGCACCGACATAAGAAGBLP:AAGTTGGGTAACGCCAGGF1cTqT0cGccAGCTGGCGAAAGGTTTTCCCAGTCACGACGTTCAAATAGAGGACCT纹ACAGTGGCGTAATAGCGAAGAB1cGGATGTGCTGCAAGGCGGTTGGGTAACGCCAG町 GGAGTCAAAG胛AAGC寸冖0叩丨曲一卜zHHTs中华人民共和国出人境检验检疫行 业 标 准出口食 品中转基 因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第1 5 部分:大豆A 2 7 0 4-1 2 品系sN/T3767,1514中 国 标 准 出 版 社 出 版北京 市 朝 阳区和平 里西街 甲2号(100029)北京 市 西城 区三里河 北街16号(100045)总编 室:(010)6
