1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准sN/T3767。-2014出口食品中转基因成分环介导+E+TTg(LAMP)TOUU fi iEffi 7 frl3r),EiK MrR604 ffi eLoop-mediated isothermal amplification detection method for geneticaltymodiried ffi;iilH#;i;T export-2010 13发布2014-0g01实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发布sN/T3767,7-2014亠一一日艹刚SN/T3767食品中转基 因成分环介导等温扩增(LAMP)
2、检测方法 共分为30部分:第1部分:通 用要求和定义;第2部分:筛 选方法;第3部分:玉 米Bt11品系;第4 部分:玉米B t 1 7 6 品系;第5 部分:玉米G A 2 1 品系;第6 部分:玉米M I R 1 6 2 品系;第7 部分:玉米M I R 6 0 4 品系;第8 部分:玉米M O N 8 1 0 品系;第9 部分:玉米M O N 8 6 3 品系;第1 0 部分:玉米M O N 8 8 0 1 7 品系;第1 1 部分:玉米M O N 8 9 0 3 4 品系;第12部分:玉 米T-25品系;第13部分:玉 米3272品系;第1 4 部分:玉米5 9 1 2 2 品系;第1
3、 5 部分:大 豆A 2 7 0 4 1 2 品系;、第1 6 部分:大豆A 5 5 4 7 1 2 7 品系;第1 7 部分:大豆D P 3 5 6 0 4 3 品系;第1 8 部分:大豆G T 泓 0 3 2 品系;第1 9 部分:大豆M O N 8 9 7 8 8 品系;第部分:水 稻Bt63品系;第21部分:水 稻KF6品系;第22部分:水 稻KF8品系;第23部分:水 稻KMD品系;第2 4 部分:水 稻L L R I C E 6 2 品系;第25部分:水 稻M12品系;第2 6 部分:水稻T 1 G 1 9 品系;第27部分:水 稻T2A1品系;第2 8 部分:小麦B 7 3-6
4、1 品系;第29部分:甜 菜H 1品系;第30部分:油 菜RT73品系。本部分为SN/T3767的第7部分。本部分按照GB/T1.109给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分 由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中 华人 民共和国广东出入境检验检疫局、仲恺农业工程学院、中华人 民共和 国汕头出人境检验检疫局、中华人 民共和国北京 出人境检验检疫局、中华人 民共和 国上海 出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人 民共和国天津 出人境检验检疫局、中华人 民共和国辽宁出人境检IsN/T3767.7-2014验
5、检疫局、中华人 民共和国珠海出人境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:凌 莉、刘津、易敏英、高苏娟、蔡颖、刘静宇、卓锦雪、曾静、李晓虹、陈颖、郑文杰、曹际娟、冯家望、李志勇、石磊、张隽、陈源树、李婷、关丽军。出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第7部分:玉 米MIR604品系1 范围SN/T3767的本部分规定 了食筛检测方法。本部分适用于玉米及其加工产本方法的定性检测低限为0.52 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是,仅 注 日期 的版本适用于本文件。凡是不注 日期的引用文件,其文件。GB/T6682 分析实验室用水GB/T19495.2 转基 因
6、 产 品GB/T19495,3 转基 因 产 品 检 测GB/T19495,7 转基 因 产 品 检 测核酸提取纯化和制样转基因植物及其产品成分检测米M定性PCR方法(农 业部1485号公告6 10)SN/T3767.22014 出口选方法3 防污染措施MP)检测方法 第2部分:筛环介导等温扩增检测过程的防4 抽样与制样B/T1按照G B/T 1 9 4 9 5.7 的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6.1.1 一般原理根据转基 因玉米MIR604品系外源基因和玉米边界序列设计 的内、外引物各一对及环状卞游引物sN/T3767.7
7、-2014的环介导等温扩增(LAMP)初成分的定性检测。sN/T3767,72014一条,特 异特性 目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别 目标序列上的六个独立区域,利用Bs莎酶启动循环链置换反应,在 玉米MIR604品系特异 目标序列启动互补链合成,在 同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合,产 生副产物(焦 磷酸镁)形 成乳 白色沉 淀,加 人显色液,即 可通过颜色变化观察判定结果。6.1,2 显色液显色原理SYBR Green I是一种高灵敏的DNA荧光染料,可 以嵌人方式结合到双链DNA的
8、小沟 内。当它与双链DNA结合时,荧 光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时,SYBR染料分子的荧光信号不发生改变,颜 色显现为橙色;当 发生扩增反应时,随 着双链DNA的增加,SYBR染料 的荧光信号也随之大幅度增强,其信号强度可代表双链DNA分子的数量,同 时颜色由橙色变为绿色。6,2 仪器和设备6,2.1 超纯水发生器。6,2.2 水浴锅或加热模板:6 3,0 0,5 和8 0.0 0,5。6,2.3离心管:0,1mL、1,5mL。6.2,4 移液器:量 程0,5 u L 1 0 u L;量程1 0 u L 1 0 0 u L;量程1 0 0 u L 1 0 0 0 u
9、L。6.2,5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外,所 有试剂均为分析纯或生化试剂。6,3,1 实验用水:应 符合GB/T6682中一级水 的规格。6,3.2 d N T P s 溶液:每种核苷酸浓度1 0 m m。l/L。6,3.3 B s 彦D N A 聚合 酶(如:N E B 公 司 或 具 有 同 等 效 果 的D N A 聚合 酶):酶 浓 度8 U/u L。6.3.4 1 0 T h e r m o l P o l 缓冲液:含2 0 0 m m o l/L T h s H C L(p H 值为8.8)、1 0 0 m m o l/L 硫酸铵、1 0 0 m m o l/I 氯化
10、钾、m m l/L 硫酸镁、1%T r o n 1 0 0。6.3,5 硫酸镁溶液:1 5 0 m m o l/L。6.3,6 甜菜碱:5 m o l/L。6.3.7 显色液:S Y B R G r e e n I 荧 光染料,1 0 0 0。6,3,8 引物:根 据转基因玉米MIR604品系外源基 因和玉米边界序列设计一套特异性引物,包 括外引物1,外引物2,内引物1和内引物2,下游环引物。外引物扩增片段长度:356bp夕 卜 引 物1(F3,5-3):AATCTGCCTATCGAGAAGA夕 卜 引 姥 勿2(B3,5-3):CGGTTCTGTCAGTTCCAA内 弓u吻1(FIP,5,-
11、3):GTGTGATCTGGCGTCCAGGAACCAGTGAATGGAGATG内 引 吻 勿2(BIP,5-3):CGCACGCAATTCAACAGAACCTTAATTCTCCGCTCATG下游环引物(BLP,53):CGGGAAACGACAATCTGA6.4 实验步骤6.4.1 阴性对照、阳性对照和 空 白对 照 的设 置6.4.1,1 阴性对 照:采用不含有待测基 因序列 的植 物基 因组DNA为模板。2sN/T3767,7-2o146.4.1.2 阳性对照:采用含有 目标基 因序列的植物DNA或质粒DNA作为模板,浓 度应略高于方法检测低限。6,4,1,3 设两个空 白对照:提取DNA
12、时设置的提取空 白对照(以水代替样品);LAMP反应的空 白对照(以 DNA溶解液代替DNA模板)。6,4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行 内源基因检测,结 果 阳性则表 明从样 品中提取的DNA可以进行外源基 因检测;否 则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照本SN/T3767,214的规定进行。6,4.3 玉米MIR604品系 LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样 品各做2个平行管。加样时应使样晶DNA溶液完全加人反应液中,不 要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后,将 1uL显色液滴在管盖 内侧,盖管盖时应小心,防 止显色液混合进人反应液中。表 1 玉米MIR6
13、04品系LAMP反应体 系6,4,4 L A M P 反应参数6 3,0 o,5 恒温扩增6 0 m i n,8 0.o o.5 5 m i n 使酶灭活,反应结束。6.4,5 显色反应反应结束后,将 显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀,立 即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实 验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合 以下情况。否则,任一种对照如果出现非下述正常结果,应 重做实验。6,5.2 空白对照:反 应管中液体呈橙色。组 分工作液浓度加样量/lI反应体系终浓度T h e r m P l 缓冲液1外引物1(F3)1 0 u m o l/Lo,50.2 u m
14、 o l/L夕 卜 引爿 勿2(B3)10uml/L0.2 u m o l/L内引物1(FIP)40umol/L1,01,6umol/L内引物2(BIP40umol/L1.6umol/L下游环引物(BLP)20umol/L0,8 u m o l/LdNTPs1 0 m m l/L1.4mml/L甜菜碱5mol/L40,8mol/L硫酸镁150mmd/Ll6mmol/LB s 莎D N A 聚合酶8U/uL10.32U/uLDNA模板100 nglplB ng/pL水补足至 25.0sN/T3767,7-20146.5.3 阴性对照:反 应管 中液体呈橙色。6.5.4 阳性对照:反 应管中液体呈
15、绿色。7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管 中液体均呈橙色,同 时各种实验对照结果正常,可 判断该样 品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管 中液体至少1管呈绿色,同 时各种实验对照结果正常,可 判断该样 品转基因玉米MIR604品系初筛阳性,还 应通过下列方法之一进行确证(见 附录A):按照农业部1485号公告按照欧盟的方法(CRLV可对外引物PCR扩增产8 结 果表述8.1 检测结果为阴性,表 述为“该样M I R 6 0 4 品系”。8.2 检测结果 为转基 因玉米MI表述。证 实验情况进行 结果判 断和附 录 A(资 料性 附录)转基 因玉米MIR604品系基
16、 因序 列A,1 转基因玉米M I R 6 0 4 品系特异目标序列(来自A c c e s s i o n n o,D J 4 3 7 6 5 1.1)556AATCT GCCTATcGAG AAGAGAAGAA601GGCCTCTTCTGGGGCATTT GGG叮GTGAA661G胛GCTGCTCAG721GGCTGGCTGGsN/T3767.7-2014ATGGGGCCAcC0GTG丿屺刂 G GAG丿叮 GG丿 CGACGGGGGGAG CTGGCTGGCTCGAGG GGCGAG、(X CAG%骈AAGCCGm CGTTTGG丿屺CAAATTcGTcc儿GGG纹GTcA cGT叮 G丿 ccTGAG GAACc GA.2 引物碱基序列及构成F3:AATCTGcCTATcGAGB3:CGGTTCTGTCAGTTCFIP:BIP:781841901GTGTGATCTGGcGTcCACGCACGCAATTCAABLP:CGGGAAACGACAA寸冖0八卜z丌Ns中华人民共和国出人境检验检疫行 业 标 准出口食 品 中转基 因成分环 介导等温扩增(LAMP)检测方法第7部分:玉 米M
