1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准sN/T3767.1-2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第17部分:大 豆 DP356043品系Loop-mediated isothermal amplification detection method for geneticatlymodified components in food for export-Part 17:Soybean DP35604314-O卜13发布2014-0g01实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发 布sN/T3767.17-2014亠刖亠一一曰SN/T3767出口食
2、品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法 共分为30部分:第1部分:通 用要求和定义;第2部分:筛 选方法;第3部分:玉 米Bt-11品系;第4部分:玉 米Bd76品系;第5 部分:玉米G A 2 1 品系;第6 部分:玉米M I R 1 6 2 品系;第7 部分:玉米M I R 6 0 4 品系;第8 部分:玉米M O N 8 1 0 品系;第9 部分:玉米M O N 8 6 3 品系;第1 0 部分:玉米M O N 8 8 o 1 7 品系;第1 1 部分:玉米M O N 8 9 0 3 4 品系;第1 2 部分:玉米T 2 5 品系;第1 3 部分:玉米3 2 7 2 品系;第1
3、 4 部分:玉米5 9 1 2 2 晶系;、第1 5 部分:大豆A 2 7 0 4 2 品系;第1 6 部分:大 豆A 5 5 4 7 2 7 品系;第17部分:大 豆 DP356043品系;第18部分:大 豆 GTS4032品系;第19部分:大 豆 MON89788品系;第部分:水 稻Bt-63品系;第21部分:水 稻KF6品系;第22部分:水 稻KF8品系;第23部分:水 稻 KMD品系;第扭部 分:水 稻L L R I C E 6 2 品系;第2 5 部分:水稻M 1 2 品系;第2 6 部分:水稻T 1 G 1 9 品系;第27部分:水 稻T2A1品系;第2 8 部分:小麦B 7 3
4、6 品 系;第29部分:甜 菜H71品系;第30部分:油 菜R 73品系。本部分为SN/T3767的第17部分。本部分按照 GB/T1,109给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中 华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国中山出人境检验检疫IsN/T3767,17-2014局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:冯 家望、唐食明、曾静、李志勇、邝筱珊、王小玉、胡松楠、游淑珠、刘李登、陈敬、
5、常彦磊。sN/T3767.17-2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第17部分:大 豆 DP356043品系1 范 围SN/T3767的本部分规定了大豆及其加工产品中转基因大豆 DP356043品系特异性的环介导等温扩增(LAMP)筛选检测方法。本部分适用于大豆及其制本方法的定性检测低限为2 规范性引用文件的定性检测。下列文件对于本文件的应用日期的引用文件,仅 注 日期的版本适用于本文件。凡是不注 日期的引用文件,邑用于本文件。GB/T6682 分析实验室GB/T19495.2 转基 因 产GB/T19495.3 转基 因 产G B/T 1 9 4 9 5.7 转基
6、因 产 品 检 测抽样和制SN/T3767.214 出口食基 因增(选方法LAMP)检测方法 第2部分:筛逞:PCR(specific method for theCRL VLO4/07VR 大豆604quantification of soybean eve3 防污染措施3-5环介导等温扩增检测过程4 抽样与制样按照G B/T 1 9 4 9 5,7 的规定执行。5 核酸提取纯化按照G B/T 1 9 4 9 5.3 的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6.1.1 一般原理根据转基因大豆DP356043品系外源基 因和大豆边界序列设计特异性 内引物和外引物各一对或者1sN/T3767
7、.17-2014添加一条或一对环引物,特 异性 目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别 目标序列上的六个独立区域,在 反应缓冲液中脱氧核糖核酸三磷酸、寡核苷酸引物在Bs莎聚合酶的作用下启动循环链置换反应,在 特异 目标序列启动互补链合成,在 同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合,产 生副产物(焦 磷酸镁)形 成乳白色沉淀,加 入显色液,即 可通过颜色变化观察判定结果。在反应混合体系中不应存在DNA聚合酶的抑制剂。在设置合适对照和在检测下限的情况下,定 性检测结果可清楚判断样品是否为转基因产品。6.
8、1,2 显色液显色原理SYBR Green I是一种高灵敏的DNA荧光染料,可 以嵌人方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时,荧 光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时,SYBR染料分子的荧光信号不发生改变,颜 色显现为橙色;当 发生扩增反应时,随 着双链DNA的增加,SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强,其 信号强度可代表双链DNA分子的数量,同 时颜色由橙色变为绿色。6.2 仪器和设备6.2,1 超纯水发生器。6,2.2 水浴锅或加热模板:6 3.0 0.5 和8 0.0 0.5。6.2.3离心管:0,1mL、1.5mL。6.2.4 移液器:量程0.5 u
9、L 1 0 u L;量程1 0 u L 1 0 0 u L;量程1 0 0 u L 1 0 0 0 u L。6,2,5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外,所 有试剂均为分析纯或生化试剂。6,3,1 实验用水:应 符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 d N T P s 溶液:每 种核苷酸浓度1 0 m m。l/L。6.3.3 B s 莎D N A 聚合 酶(如:N E B 公 司 或 具 有 同 等 效 果 的D N A 聚合 酶):酶 浓 度8 U/u L。6.3,4 1 0 T h e r m o l P o l 缓冲液:含0 m m o l/L T s H C l(p H
10、 值为8.8)、1 0 0 m m o l/L 硫酸铵、1 0 0 m m o l/L 氯化钾、m m。l/L 硫酸镁、1%T t o n 1 0 0。6.3.5 硫酸镁溶液:1 5 0 m m o l/L。6.3.6 甜菜碱:5 m。l/L。6,3,7 显色液:S Y B R G r e e n I 荧光染料,1 0 0 0。6,3.8 引物:根 据转基因玉米Bt11品系外源基 因和玉米边界序列设计一套特异性引物,包 括外引物1,外引物2,内引物1,内引物2,环引物1和环引物2。外引物扩增片段长度:244bp夕卜 引物1(F3,5-3):GCCATAACCTCATCTCGC夕卜 引 物2(B
11、3,5-3):TGGTCTTCTGAGACTGTATCTT内 引 物1(FIP,5-3):AGCCTATTCGACCTAACGACCTATACTAGAGCCATCGTAGGAG内 引 彬 勿2(BIP,5-3):ACTAAGGCCGCTCTAGAGATCCATTCTTGGAGTAGACGAGAGT环 引 牛 勿1(FLP,5-3):AAGTCGATCGGTCAAGAATCC环 引 铭 勿2(BLP,5-3):TCAACATGGTGGAGCACG2sN/T3767,17-20146.4 实验步骤6.4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1,1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基
12、因组DNA为模板。6,4.1.2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有 目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。6,4.1.3 设两个空白对照:提取DNA时设置的提取空白对照(以 水代替样品);:iLAMP反应的空白对照(以 DNA溶解液代替DNA模板)。6,4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测,结 果阳性则表明从样品中提取的DNA,可以进行外源基因检测;否 则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767,214的规定进行。6,4.3 大豆 DP356043品系 LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样
13、品DNA溶液完全加人反应液中,不 要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后,将 1uL显色液滴在管盖内侧,盖 管盖时应小心,防 止显色液混合进人反应液中。表1 大 豆 DP356043品系LAMP反应体系组 分工作液浓度加相 翅 量/uL反应体系终浓度ThermoPol缓冲液1夕 卜 引物1(F3)10mol/L0,2um。l/L夕 卜 引物2(B3)10umol/L0,2 u m o l/I 内引物1(FIP)4 0 u m o l/L1,01,6umo1/L内引物2(B I P)40umol/L1,01,6uml/L环弓 H勿1(FLP)20umol/L1.00.8 pmol/L环 引 物2(
14、BLP)20umol/L1,008umol/LdNTPs1 0 n n m o l/L1.6mmo1/L甜菜碱5mol/L40,8 m o l/L硫酸镁150mmol/L16mm l/LB“D N A 聚合 酶8U/uL10,3 2 U/u LDNA模板100 ng/pL8 ng,/pL水补足至 25,0sN/T3767.17-20146.4.4 LAMP反应参数6 3.o 0.5 恒温扩增9 0 m i n,8 0.0 0.5 5 m i n 使酶灭活,反 应结束。6.4.5 显色反应反应结束后,将 显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀,立 即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制-,5.1
15、基本原则:实 验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则,任一种对照如果出现非下述正常结果,应 重做实6.5.2 空白对照:反 应管中液6.5.3 阴性对照:反 应管中液6.54 阳J眭对照:反 应管中液7 结 果判断和确证7,1 待检样品2个平行样反应果为阴性。验对照结果正常,可 判断该样品检测结7,2 待检样品2个平行样反应实验对照结果正常,可 判断该样 品转基因大豆DP356043品系初证(见 附录A):按 照 J R C 方法C R L V L 0 4/0 7 V R 进行 实检测;可对外引物PCR扩增产序列8 结 果表述8.1 检测结果为阴性,表 述未检3品一豆 应验情
16、况进行结果判断和表述。8.2 检测结果为转基因大豆sN/T3767.17-2014附 录 A(资料性 附录)转基 因大豆 DP356043品系基 因序 列A。1 转基 因大豆 DP356043品系外源基 因和大豆边界序 列70GCCAD%纹CCTG灯CTCGCCTTCG叹CCGCACG驭3 AGAGG屺屺 CCG1卢C1冫GAGCTGAAA130GAATACTAGACTTTTGCCCGAGGTC190GT纹 QGTCGAATAGGC冂EAG丿叮 C TG250AG叮 GGTGGACX3ACG310ACCAA。2 引物碱基序列及构成F3:GCCATAACCTCAB3:TGGTCTTCTGAGACTGF 1 cFIP:AGCCTATTCGACCTAAB1cBIP:ACTAAGGCCGCTCTAGAGCGAGAGTFLP:AAGTCGATCGGTCAABIP:TCAACATGGTGGAGC旭 G GTCTG蛇AAG寸冖0丨卜卜卜卜z中华人民共和国出人境检验检疫行 业 标 准出口食 品中转基 因成分环 介导等温扩增(LAMP)检测方法第17部分:大 豆 DP356043品系sN/T3767,1
