1、SN/T4097-2015贝类派琴虫实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了贝类中派琴虫的实时荧光PCR检测方法。本标准适用于贝类组织中派琴虫的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1实时荧光PCR real-time fluorescent PCR在普通聚合酶链反应的基础上加入一条特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针
2、老整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收：PC扩增时，Tg酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，达到实时定量的目的3.2Ct值cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的圆值时所经历的循环数，也可称为Cp值。4试剂和材料4.11mol/L TrisCl(pH8.0)、0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0)、SDS(10%)。溶液配制见附录A。4.2蛋白酶K溶液(20mg/mL)。4.3Tris-饱和酚。4.4三氯甲烷。4.
3、5异戊醇。4.6无水乙醇。4.7生理盐水。4.810PCR buffer、25mmol/L MgCl2、2.5mmol/L dNTP、5U/uL Taq酶。4.9104mol/L上游引物、10umol/L下游引物、10umol/L探针。4.10TE缓冲液(pH8.0)。1SN/T4097-20155仪器和设备5.1组织研磨器。5.2电子天平。5.3冷冻离心机。5.4涡旋振荡器。5.5水浴锅。5.6超纯水机。5.7冰箱(28、-20、-80)。5.8高压灭菌锅。5.9实时荧光PCR仪。6检测步骤6.1取样选取颜死的新鲜贝类样品，或者有感染派琴虫临床症状的样品（消化腺发白，贝壳不能闭合，套膜收缩，
4、性腺发育受到抑制，生长迟缓等)。采集贝类的腮、套膜和消化腺等组织25mg,置于冰冷的生理盐水中反复冲洗，用滤纸吸干表面水分，在液氮中冻5mi,放至室温，再置于匀浆研磨器中并加入冷的生理盐水50L,进行手工匀浆研磨。6.2DNA提取和纯化6.2.1将匀浆液倒人1.5mL离心管中，加入生理盐水补充体积至200L,加20L蛋白酶K(20mg/mL),再加SDS至终浓度为1%，上下颠倒混匀。6.2.2混合液置于55水浴锅内水浴2.5h。6.2.3向匀浆液中按1：1比例加入苯酚：三氯甲烷：异戊醇混合液(A.5),上下颠倒混匀，12000r/min离心5min。6.2.4转移上层水相，加入等体积三氯甲烷：
5、异戊醇混合液(A.6),上下颠倒混匀，12000r/min离心5min。6.2.5转移上层水相，加入两倍体积的无水乙醇，一20放置30min或过夜。6.2.612000r/min离心5min,沉淀DNA,倾去上清液。6.2.7于沉淀中加入75%乙醇溶液500L,轻轻混匀后12000r/min离心5min,倾去上清液，室温晾干。6.2.8用20LTE缓冲液溶解DNA沉淀，一20保存备用。组织DNA提取也可采用等效的商品化DNA提取试剂盒，按照说明书进行操作。6.3实时荧光PCR检测6.3.1实时荧光PCR引物该引物扩增派琴虫核糖体DNA序列中的ITS区域基因序列，扩增片度长度为69bp,参见附录B。上游引物：5-TCAAAACGAAATTCCAAACTCTCA-3下游引物：5CTTCGCTGCGTCCTTCATC-3Taqman探针：5-FAM-CGATGGATGCCTCGGCTCGAG-ECLIPSE-32
