1、SN/T4397-20157检测步骤7.1DNA提取71.1从原始样品中取出部分有代表性的样品，用绞碎机绞碎，充分混匀。称取0.1g经混匀的肉及肉制品于2mL离心管中，加入1.5mL的ddH2O洗涤两次，加人600 L CTAB缓冲液和40L蛋白酶K,651h,期间每隔10min振荡混匀。7.1.2加入500L酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液，体积比为25：24：1；3000r/min涡旋振荡混匀，12000g离心10min。7.1.3吸取上清液至一新离心管中，加入等体积的异丙醇，振荡混匀12000g离心10min。7.1.4弃去上清液，用预热至65TE缓冲溶液溶解DNA7.1.5加入5 uL R
2、NA酶溶液，3730min7.1.6加入200L三氯甲烷：异戊醇(24：1)，3000r/min涡旋振荡混匀，12000g离心10min。7.1.7吸取上清液至一新离心管中，加入等体积异丙醇，振荡混匀，12000g离心10min。7.1.8弃去上清液，70%乙醇洗涤一次，2000g离心10min。7.1.9弃去上清液，晾干；加入50LTE缓冲液，溶解DNA沉淀7.2DNA浓度和纯度的测定7.2.1取适量DNA原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值。DNA的浓度按照式(1)计算：c=A26XNX504*44444444(1）式中：c
3、一DNA浓度，单位为微克每微升(g/L):A260260nm处的吸光值：N核酸稀释倍数。7.2.2当浓度为104g/mL1mL,Ao/A8o比值在1,71.9之间时，适宜于PCR扩增。7.3实时荧光PCR扩增7.3.1实时荧光PCR反应体系反应总体积为25L,其中含样品DNA(10g/mL00g/mL)2L,牦牛引物对(104mol/L)各1L,牦牛探针(5umol/L)1L,Tag DNA聚合酶(5U/uL)0.5aL,dNTP(10amol/L)1aL,10XPCR缓冲液2.5L,用水补齐至总体积25L。也可采用商品化的PCR扩增体系。真核生物内参照的反应体系同上，仅以真核生物引物对和探针替换牦牛引物对和探针。7.3.2实时荧光PCR反应参数牦牛特异性引物探针：50/2min,9510min;40个循环为95/15s,57/30s。真核生物引物探针：50/2min,9510min;40个循环为95/15s,60/1min.7.3.3实验对照检测过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以牦牛提取的DNA为阳性对照，以已知不含有牦牛成分的样品提取的DNA为阴性对照，以灭菌水作为空白对照。样品、内参照和对照设置两个平行反应体系。
