1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 52822020虾偷死野田村病毒病检疫技术规范Quarantine protocol for infection with covert mortality nodavirus2020-12-30 发布2021-07-01 实施ICS 11.220CCS B 41中华人民共和国海关总署发 布SN/T 52822020I前 言本文件按照 GB/T 1.12020 给出的规则起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关，中国水产科学研究院黄海水产研究所。本文件主要起草人：于力、张庆利、史秀杰、刘爽、王津津、郑晓
2、聪、刘荭、黄倢。1SN/T 52822020虾偷死野田村病毒病检疫技术规范1 范围本文件规定了虾偷死野田村病毒病临床症状、组织病理、套式聚合酶链反应、实时荧光逆转录聚合酶链反应和原位杂交的检测方法。本文件适用于虾偷死野田村病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18088 出入境动物检疫采样SN/T 1193 基因检验实验室技术要求3 术语
3、、定义和缩略语本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。3.1 CMNV：偷死野田村病毒（covert mortality nodavirus）3.2 RT-PCR：逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction）3.3 Nested PCR：套式聚合酶链反应（nested polymerase chain reaction）3.4 Ct：达到阈值的循环数（cycle threshold）3.5 cDNA：互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid）3.6 DEPC：
4、焦碳酸乙二酯（diethypyrocarbonate）3.7 PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline）3.8 PBST：磷酸盐吐温缓冲液（phosphate buffer saline with tween）3.9 RNase：RNA 酶（ribonuclease）3.10 dNTPs：三磷酸脱氧核苷酸（deoxynucleotide triphosphates）3.11 EB：溴化乙锭（ethidium bromide）3.12 MAB：马来酸缓冲液（maleic acid buffer）3.13 BCIP：5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（5-Bromo-4-
5、Chloro-3-Indolyl Phosphate）3.14 NBT：氯化硝基四氮唑蓝（nitroblue tetrazolium chloride）3.15 DTT：二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol）3.16 EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）4 疾病概述虾偷死野田村病毒病也叫虾病毒性偷死病，其病原为偷死野田村病毒（CMNV），属于野田村病2SN/T 52822020毒科（Nodaviridae）甲型野田村病毒属（Alphanodavirus），详细资料参见附录 A。5 试剂和材料5.1 水：符合 GB/T 6682 中一级
6、水的规格，用 DEPC 处理以除掉 RNase。PCR 实验应在符合 SN/T 1193 要求的实验室进行。5.2 CMNV 病毒参考株。5.3 Davidsons AFA 固定液：见附录 B.1。5.4 1%盐酸乙醇：浓盐酸和 70%乙醇配制。5.5 梯度乙醇：70%、80%、95%及无水乙醇。5.6 二甲苯。5.7 石蜡。5.8 苏木精染液。5.9 0.5%伊红乙醇溶液。5.10 中性树脂。5.11 逆转录酶：20 U/L，-20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。5.12 RNase 抑制剂：20 U/L，-20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。5.13 Trizol 试剂：RNA 抽提试
7、剂。5.14 Taq 酶：-20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。5.15 dNTPs：含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmoL/L。5.16 实时荧光 RT-PCR 的引物和探针的序列如下：CMNV-Taq-F：5-CGA-GCT-AAT-CCA-AGC-ACT-TC-3CMNV-Taq-R：5-ACC-TGT-TAG-GTA-CGC-TAC-CA-3探针：5-FAM-CGC-TCA-CGG-CTT-TGG-ATA-CCT-T-BHQ1-3扩增 RNA 聚合酶基因片段中 198 bp 的片段。引物和探针终浓度为 200 nmoL/L。5.17 Nested PCR 引物
8、序列5.17.1 第一步引物序列如下：CMNV-7F1：5-AAA-TAC-GGC-GAT-GAC-G-3CMNV-7R1：5-ACG-AAG-TGC-CCA-CAG-AC-3扩增 RNA 聚合酶基因片段中 619 bp 的片段。引物终浓度为 400 nmoL/L。5.17.2 第二步引物序列如下：CMNV-7F2：5-CAC-AAC-CGA-GTC-AAA-CC-3CMNV-7R2：5-GCG-TAA-ACA-GCG-AAG-G-3扩增第一步产物中 165 bp 的片段。引物终浓度为 400 nmoL/L。5.18 75%乙醇：用无水乙醇和 DEPC 水配制，使用前预冷到-20。5.19 氯
9、仿。5.20 异丙醇。5.21 DNA 相对分子质量标准：分子量大小 100 bp2000 bp 间的 DNA 片段，-20保存。5.22 4%多聚甲醛：多聚甲醛和 PBS 配制。5.23 地高辛标记 RNA 探针，序列参见附录 C。5.24 碱性磷酸酶偶联抗地高辛抗体：-20保存。5.25 PBST：含 0.1%吐温-20 的 PBS。3SN/T 528220206 器材和设备6.1 切片机。6.2 显微镜。6.3 组织研磨器。6.4 高速冷冻离心机。6.5 实时荧光 PCR 扩增仪。6.6 PCR 扩增仪。6.7 水平电泳仪。6.8 微量移液器。6.9 凝胶成像仪。7 临床症状病虾多沉入水
10、底，很少在水面活动，软壳，生长缓慢，很多情况下可见腹节肌肉发白。解剖可见肝胰腺萎缩，空肠空胃。8 检测方法8.1 组织病理8.1.1 取样和固定取肝胰腺和肌肉组织，用 Davidsons AFA 固定液固定 24 h。8.1.2 脱水、包埋和切片将固定好的组织用 70%乙醇处理 1 h，80%乙醇处理 1 h，95%乙醇处理 1 h，无水乙醇处理 30 min（重复 2 次），二甲苯+无水乙醇（体积比 11）处理 30 min，二甲苯处理 30 min（重复 2 次），二甲苯+石蜡（体积比 11）处理 15 min，石蜡处理 15 min（重复 2 次），石蜡包埋，切片，切片厚度约 3 m。切
11、好的片子用于染色或者原位杂交。各步骤的时间可根据样品情况作适当调整。8.1.3 染色将切片用二甲苯处理 5 min（重复 2 次），二甲苯+无水乙醇（体积比 11）处理 5 min，无水乙醇处理 5 min，95%乙醇处理 5 min，80%乙醇处理 5 min，70%乙醇处理 5 min，双蒸水洗涤，苏木精染色，双蒸水洗涤，1%盐酸乙醇处理，双蒸水洗涤，0.5%伊红染色，双蒸水洗涤，70%乙醇处理5 min，80%乙醇处理 5 min，95%乙醇处理 5 min，无水乙醇处理 5 min（重复 2 次），二甲苯+无水乙醇（体积比 11）处理 5 min，二甲苯处理 5 min（重复 2 次）
12、，最后用中性树脂封固，显微镜下观察。各步骤的时间可根据样品情况作适当调整。8.1.4 结果判定8.1.4.1 典型组织病理病变为：肝胰腺组织的肝胰腺小管上皮细胞中可见嗜酸性包涵体；肌肉组织可见凝固状坏死，坏死肌纤维中有血细胞浸润，浸润血细胞的细胞核出现核固缩（参见附录 D）；8.1.4.2 组织病理方法只用作初步判定。若检测样品中观察到典型病变，判定为可疑病例，需要用本标准其他方法确诊。4SN/T 528220208.2 Nested PCR8.2.1 样品采集按 GB/T 18088 的标准采样，优先选取具有临床症状的个体。取肝胰腺、鳃和附肢。8.2.2 RNA 抽提用组织研磨器制备组织匀浆
13、，取匀浆成糊状的组织样品 25 mg 100 mg 加入到 1.5 mL 离心管。加入 1 mL Trizol，用枪头充分吹打均匀；加入 200 L 三氯甲烷，涡旋振荡 30 s；4 12000 r/min 离心15 min；取上层水相到新的1.5 mL离心管，加入500 L异丙醇，上下颠倒数次混匀，静置10 min；4 12000 r/min 离心 15 min；弃上清，沉淀物用 1 mL DEPC 水配制的 75%乙醇洗涤；4 8000 r/min 离心 10 min；弃上清，沉淀室温干燥 10 min；加入 30 L DEPC 水溶解 RNA 沉淀。提取后的 RNA 应尽快用于逆转录合成
14、 cDNA 模板。具备同样抽提效率的商业化 RNA 抽提试剂盒也同样适用。8.2.3 Nested PCR 第一步8.2.3.1 反应体系和参数在冰上配制体系，取 18.5 L（总量约 150 ng 200 ng）待测 RNA 溶液，加 10 倍逆转录酶浓缩缓冲液（见附录 B.2）2.5 L、dNTP 1 L、RNase 抑制剂 1 L、逆转录酶 1 L、下游引物（CMNV-7R1）1 L。混匀后，置 PCR 仪上 50反应 30 min，95反应 10 min，-20保存 cDNA 模板。在 0.2 mL PCR 薄壁管或八联管中，按每个样品 10 倍 Taq 酶浓缩缓冲液（见附录 B.3）
15、2.5 L、dNTPs 0.5 L、Taq 酶 0.5 L、上游引物（CMNV-7F1）和下游引物（CMNV-7R1）各 0.5 L、双蒸水18 L、cDNA 模板 2.5 L，配制反应体系。同时设置不含 cDNA 模板的空白对照、阳性对照和阴性对照，检测体系配制方法相同。95 4 min；95 30 s，45 30 s，72 40 s，35 个循环；72 7 min，4保存。具有同样扩增效率的商业化 RT-PCR 试剂盒也同样适用。8.2.3.2 电泳和产物测序用 TBE 电泳缓冲液（见附录 B.4）配制 1.5%的琼脂糖平板（含 1 g/mL EB）。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好
16、淹没胶面。将 6 L 扩增产物和 2 L 溴酚蓝指示剂溶液（见附录 B.5）混匀后加入孔内。在电泳时使用核酸分子量标准参照物作对照。5 V/cm 电泳约 0.5 h，当溴酚兰到达琼脂糖凝胶的底部时停止。用紫外照射仪或用凝胶成像仪观察扩增带并判断结果。若阳性对照出现一条 619 bp 的目标条带，阴性对照和空白对照没有该条带，实验有效；若样品出现目标条带，进行测序确认；若样品无条带，需进行 Nested PCR 第二步。8.2.4 Nested PCR 第二步8.2.4.1 反应体系和参数在 0.2 mL PCR 薄壁管或八联管中，按每个样品 10 倍 Taq 酶浓缩缓冲液 2.5 L、dNTPs 0.5 L、Taq 酶 0.5 L、上游引物（CMNV-7F2）和下游引物（CMNV-7R2）各 0.5 L、双蒸水 18 L，Nested PCR 第一步扩增产物 2.5 L，配制反应体系。同时设置不含模板的空白对照、阳性对照和阴性对照，检测体系配制方法相同。95 4 min；95 20 s，50 20 s，72 20 s，30 个循环；72 7 min，4保存。5SN/T 52822020
