1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 51932020兔球虫病检疫技术规范Quarantine protocol for rabbit coccidiosis2020-12-30 发布2021-07-01 实施ICS 11.220CCS B 41中华人民共和国海关总署发 布中华人民共和国出入境检验检疫开本 8801230 1/16 印张 1 字数 30 千字2021 年 1 月第一版 2021 年 1 月第一次印刷印数 1500书号：155175130 定价 18.00 元兔球虫病检疫技术规范行 业 标 准SN/T51932020*北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023）编辑部
2、：（010）65194242-7509中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷中国海关出版社有限公司出版发行网址 51932020I前言本文件按照 GB/T1.12010 的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广州海关、中华人民共和国太原海关。本文件主要起草人：吕继洲、袁向芬、张舟、吴绍强、邓艳、王彩霞、巩红霞、张永宁。SN/T 519320201兔球虫病检疫技术规范1 范围本文件规定了兔球虫病检疫时的样品采集、病原形态学观察以及 PCR 检测等技术规范。本文件适用于活兔、带肝脏兔胴体球虫感染情况的检测，也适用于兔养殖场兔球虫病的流行
3、病学调查和监测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682 分析实验室用水规模和试验方法3 术语、定义和缩略语本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）SDS：十二烷基硫酸钠（SodiumDodecylSulfate）4 疫病概述参见附录 A。5 材料5.1 除另有规定外，
4、所用化学试剂均为分析纯。试验用水要求达到 GB/T6682 中一级水的要求。5.2 基因组 DNA 抽提试剂盒、PCR缓冲液、dNTP、DNA 聚合酶、DNAMarker、蛋白酶 K、氯化钠、重铬酸钾、三氯甲烷、SDS、异丙醇、琼脂糖、无水乙醇等，均为商品化试剂。5.3 饱和氯化钠溶液、2.5%重铬酸钾溶液、0.5%SDS消化液、裂解液、20mg/L蛋白酶K溶液、酚/三氯甲烷/异戊醇溶液、70%乙醇、3mol/L乙酸钠溶液、电泳缓冲液、生理盐水的配制方法见附录 B。5.4 艾美耳球虫 Eimeia spp.通用引物：ITS1-F：5-GGGAAGTTGCGTAAATAGA-3；ITS1-R：5
5、-CTGCGTCCTTCATCGAT-3。引物合成后均采用灭菌 ddH2O 稀释为 10 mol/L（具体序列见附录 C）。5.5 PCR 检测阴阳性对照：阳性对照为 11 种兔球虫 DNA 基因组中的一种，阴性对照为健康兔肝（肠）组织样品。SN/T 5193202026 仪器设备与耗材天平、镊子、载玻片、漂浮管、自封袋、60目小铜筛、显微镜、制冰机、冰箱（4、-20、-80）、高压灭菌器、冷冻离心机、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像仪或紫外透射仪、微量可调移液器及吸头、1.5mL 离心管等。7 检测方法7.1 样品采集7.1.1 肝脏、肠病灶样品采集切取肝脏结节病灶、肠粘膜结节病灶组织，每份 2
6、0g 左右，装入干净的自封袋中，标明编号，记录兔的年龄、品种、饲养卫生条件等，置 4保存，待处理镜检。7.1.2 活兔粪便样品采集活兔隔离检疫期 30d，隔离第 1 天和隔离第 12 天分别采集兔子粪便两次。取样前，先将一层保鲜膜铺在兔笼下面。3 h 后从保鲜膜上取样，不管兔日龄大小，以兔个体为单位，采集新鲜粪便一份 20 g 左右。装入干净的自封袋中，标明编号，记录兔的年龄、品种、健康状况、用药、饲养卫生条件等情况，置 4保存，待处理镜检。7.2 形态学鉴定7.2.1 肝脏、肠病灶镜检肝组织镜检可见肝细胞萎缩，胆管上皮增生，呈乳头状突起，上皮细胞变性坏死。肝脏组织结节压片可见大量的球虫卵囊。
7、肠粘膜坏死脱落，肠粘膜涂片检查可见球虫卵囊。7.2.2 活兔粪便的处理与镜检7.2.2.1 每份粪样称取 3g，用玻璃棒捣碎后与 50ml 生理盐水搅成混悬液。7.2.2.2 将粪便混悬液经60目小铜筛过滤到第二个容器内，并将第二个容器内的过滤液倒入离心管中。7.2.2.3 3000r/min 离心 3min，弃去上清液。7.2.2.4 向沉淀中加入 10ml 饱和氯化钠溶液，充分混匀。7.2.2.5 3000r/min 离心 3min。7.2.2.6 用捞网捞取表面浮液抖落于盛水的容器中。7.2.2.7 将卵囊转入已加有 2.5%重铬酸钾溶液的培养皿中，混匀，液面高度小于 1cm，做好标记，
8、放置于 28摇床内孢子化培养 48h72h，每隔 12h 观察孢子化情况，孢子化率达到 80%以上，收集卵囊放于 4冰箱保存。7.2.3 形态特征将卵囊置于载玻片上，100 倍光学显微镜下观察，卵囊呈卵圆形或近似圆形，少数呈椭圆形或梨形，形态随虫种而定，囊膜壁较厚，一般有两层，能明显看到蛋壳状结构，无色、淡黄色、金黄色等。在 100 倍光学显微镜下对卵囊定位后，在 400 倍光学显微镜下进一步观察卵囊形状和结构。兔艾美耳球虫卵囊模式图及 11 种兔球虫卵囊的形态特征见附录 D。SN/T 5193202037.3 PCR 检测7.3.1 PCR 引物本方法所使用的引物序列如下：Eimeiaspp
9、.ITS1-F：5-GGGAAGTTGCGTAAATAGA-3Eimeiaspp.ITS1-R：5-CTGCGTCCTTCATCGAT-37.3.2 样品制备取兔球虫卵囊（或病灶组织）沉淀 25mg 置于离心管按照附录 E 中提取组织 DNA 的方法提取DNA，也可采用商品化的组织 DNA 提取试剂盒。7.3.3 PCR 反应体系取 2 L 提取的样品 DNA 作为模板，加入按照表 1 配制的 PCR 反应液中。同时设立阴阳性对照，设立 ddH2O 为空白对照。表 1PCR 反应液的配制（等效化试剂可用）组分每管用量/L10PCR缓冲液（含 Mg2+）2.5dNTPMixture（2.5mmo
10、l/L）2DNAtaq 聚合酶（1U/L）0.5EimeriasppITS1-F1EimeriasppITS1-R1灭菌蒸馏水16模板 DNA2总体积257.3.4 PCR 反应程序94预变性 2min；94变性 1min，58退火 1min，72延伸 1min，32 个循环；最后 72延伸 7min；4保存。7.3.5 琼脂糖电泳取 5 LPCR 扩增产物，进行 1.5%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，用凝胶成像仪或者紫外透射仪观察结果。7.3.6 结果判定7.3.6.1试验成立的条件阳性对照扩增有目的条带，且经测序比对后其同源性最近序列指向的兔球虫虫种与阳性对照所属兔球虫虫种一致，阴性对照无
11、相应片段。否则试验无效。7.3.6.2可疑判定样品有扩增条带，判定样品为兔球虫感染可疑。SN/T 5193202047.3.6.3阴性判定样品无扩增条带，判定样品为兔球虫感染阴性。7.3.6.4阳性判定样品有扩增条带，将扩增获得的产物或电泳条带纯化后，直接测序或进行 T 载体克隆测序。将测序获得的序列与 Genbank 数据库中的序列进行 BLAST 分析比对，如果同源性最近序列指向某种兔球虫，可判定样品为该兔球虫感染阳性；如果同源性最近序列指向与各种兔球虫均无关的序列，则判定样品为兔球虫感染阴性。8 结果综合判定8.1 可疑判定PCR 检测时，样品有扩增条带，判定样品可疑。8.2 确诊判定在
12、肝组织或肠粘膜中镜检发现球虫卵囊，根据形态学鉴定感染种类，卵囊形态特征可疑的样品提取 DNA 进行 PCR 扩增，根据 PCR 结果及测序比对分析结果进行感染情况判定。SN/T 519320205附录A（资料性）兔球虫病兔球虫病是家兔中最常见的也是危害最严重的寄生虫病，主要是由寄生在肠道和胆管上皮细胞的艾美耳属球虫引发的。世界各地已报道的可寄生于兔的艾美耳球虫有十几种，目前被公认的艾美耳球虫（Eimeria）有 11 种：包括小型艾美耳球虫（E.exigua）、盲肠艾美耳球虫（E.coecicola）、斯式艾美耳球虫（E.stiedai）、肠艾美耳球虫（E.intestinalis）、维氏艾美
13、耳球虫（E.vejdovskyi）、中型艾美耳球虫（E.media）、梨型艾美耳球虫（E.piriformis）、穿孔艾美耳球虫（E.perforans）、无残艾美耳球虫（E.irresidua）、黄艾美耳球虫（E.flavescens）、大型艾美耳球虫（E.magna）。根据球虫的寄生部位可分为肠型、肝型和混合型 3 种。开始时病兔食欲减退、精神沉郁、伏卧不动、生长停滞。眼鼻分泌物增多，体温升高，腹部胀大，臌气，下痢，肛门沾污，排粪频繁。肠球虫病症状有顽固性下痢，甚至拉血痢，或便秘与腹泻交替发生。肝球虫病症状则为肝脏肿大，肿区触诊疼痛，黏膜黄染。家兔球虫病的后期往往出现神经症状，四肢痉挛、麻
14、痹，因极度衰竭而死亡。肠型死亡快，肝型死亡较慢。肠型球虫病见十二指肠壁厚，内腔扩张，黏膜炎症。小肠内充满气体和大量微红色黏液，肠黏膜充血并有出血点。慢性者的肠黏膜呈灰色，有许多小而硬的白色小结节，内含有卵囊。肝球虫病症状则为肝肿大，肝表面与实质内有白色或淡黄色的结节性病灶，取结节压碎镜检，可见到各个发育阶段的球虫。日久的病灶，其内容物变为粉粒样钙化物。球虫卵囊的形态特征是球虫虫种鉴定的主要依据之一。在鉴定虫种时，应着重观察外形、大小、色泽、卵囊外膜形状，有无极粒与微孔，有无卵囊残体，孢子囊大小和形状，是否有斯氏体及孢子囊残体；子孢子的大小和形状。11 种兔球虫的形态特征以及寄生部位各不相同，例
15、如除斯氏艾美耳球虫寄生于胆管上皮细胞外，其他艾美耳球虫均寄生于肠上皮细胞内。SN/T 519320206附录B（规范性）试剂及其配制B.1 饱和氯化钠溶液在 1000mL 蒸馏水的烧杯里加入 400gNaCl，然后放在 30恒温磁力搅拌器上搅拌至完全溶解为止，制得饱和氯化钠溶液，常温保存备用。B.2 2.5%重铬酸钾溶液2.5g重铬酸钾加入 100mL 蒸馏水搅拌至完全溶解，常温保存备用。B.3 0.5%SDS 消化液0.5gSDS 放入 100mL 试剂瓶，加双蒸水定容至 100mL，4保存备用。B.4 裂解液100mmol/LNaCl，20mmol/LEDTA，20mmol/LTris-H
16、Cl，pH 为 7.5，4保存备用。B.5 20 mg/L 蛋白酶 K 溶液将 1g 的蛋白酶 K 粉末溶解于 5mL 的超纯水中，待完全溶解，得到浓度为 200mg/mL 的溶液，10 L200mg/mL 的该溶液加入 100mL 超纯水，得到浓度为 20mg/L 的蛋白酶 K 溶液。B.6 酚/三氯甲烷/异戊醇溶液按照体积 25：24：1 的比例配制，4保存备用。B.7 70%乙醇以无水乙醇与水的体积比为 7：3 的比例配制，常温保存备用。B.8 3mol/L 乙酸纳溶液称 82g乙酸钠溶于适量水中，加入 60g 冰乙酸，然后转移到 1000mL 的容量瓶中，用少量蒸馏水洗涤烧杯 23 次，洗液并入容量瓶中，再定容到刻度线即可，常温保存备用。B.9 电泳缓冲液的配制取 Tris 碱242g、冰醋酸57.1mL、0.5mol/LEDTA10mL、用 5mol/L 的 HCl 调至 pH8.0，定容至 1000mL，即为 50 倍 TAE 电泳浓缩缓冲液，用前采用蒸馏水 50 倍稀释即可。B.10 生理盐水取 0.9g 氯化钠于容器中，加蒸馏水 100 毫升，搅拌至完全溶解，于高压蒸汽
