1、书 书 书犐 犆犛 犅 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 进出口食用动物中新霉素药物残留测定酶联免疫吸附法和液相色谱质谱质谱法犇犲 狋 犲 狉犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳狀 犲 狅犿狔 犮 犻 狀狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊犻 狀犲 犱 犻 犫 犾 犲犪 狀 犻 犿犪 犾犳 狅 狉犻 犿狆 狅 狉 狋犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犈犔 犐 犛犃犪 狀 犱犔犆 犕犛犕犛 发布 实施中华人民共和国海关总署发 布书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准
2、主要起草单位：中华人民共和国青岛海关。本标准主要起草人：孙明君、邱芳、张金玲、郑小龙、张晓文、梁成珠、孙涛、岳志芹、朱来华、王群。犛犖犜 进出口食用动物中新霉素药物残留测定酶联免疫吸附法和液相色谱质谱质谱法范围本标准规定了进出口食用动物的血浆、尿液中新霉素残留的酶联免疫吸附测定方法和液相色谱质谱联用测定方法。本标准适用于进出口食用动物猪、牛、羊血液及尿液中新霉素残留量的快速检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法第一方法酶联免疫吸
3、附法原理基于竞争性酶联免疫反应，含有新霉素的抗原包被于微孔板上。药物分析时，样品同特异性一抗共同被添加到板孔中。如果样品中含有药物，会竞争一抗，抑制抗体与板上包被的药物抗原结合。加入酶标记二抗，形成包被抗原抗体酶标二抗复合物。加入底物后，产物的颜色强弱与样品中药物的浓度成反比。试剂与材料 水：中规定的二级水 碳二亚胺：分析级 卵清蛋白 牛血清白蛋白 透析袋 包被缓冲液 洗涤缓冲液 封闭缓冲液 稀释缓冲液 样品提取液 辣根过氧化物酶标记偶联物稀释液 底物液 显色剂液犛犖犜 终止液 抗体 偶联物 包被卵清蛋白偶联新霉素的聚苯乙烯微量 孔反应板 标准品：硫酸新霉素，纯度。标准品贮备液：准确称取标准品
4、，折合成目标化合物 ，用适量水溶解，并用水定容至，混匀。以下避光保存，有效期为 个月。标准品中间液：用水稀释标准储备液至，以下避光保存，有效期为个月。标准品工作液：用稀释缓冲液稀释标准中间液至工作浓度、，现用现配。注：试剂与材料所涉及各种液体配制详见附录仪器和设备 分析天平，感量 。酶标仪，带有 滤光片。离心机：转数 。超声波发生器。微量移液器：单道、和多道 。酸度计：测量范围 。涡旋式混合器。振荡器。测定步骤 试样制备与保存 试样制备分别采集动物血液 于含有肝素钠的抗凝试管中、新鲜尿液 装入洁净容器内，各分成两等份，作为试样密封并标明标记。在制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量
5、的变化。试样保存试样置于下可保存 天；若长期保存，需将试样置于 以下。提取取 样品，加 样品提取液，混匀，离心，上清液用于检测。酶联免疫测定 根据待测样品数量和标准样品（每个样品个平行），决定微孔的使用量。每孔加入 含有卵清蛋白偶联新霉素抗原包被板过夜。将微孔内液体垂直倒掉，加入 洗涤缓冲液，轻轻晃动后垂直倒掉，再重复洗涤微孔次，在滤纸上用力垂直磕掉残留在壁上的液体。犛犖犜 每孔加 牛血清白蛋白，封闭小时。操作同 。每个微孔中加入 标准溶液或待测样品溶液。在每个微孔中加入 辣根酶标记物和 抗体，混匀。室温（）避光孵育 。操作同 。每个微孔加入 底物液和 显色剂液，充分混合并在室温（）暗处孵育
6、。加入 的终止液终止反应，充分混合后 内于 处测量吸光度值。空白试验除不加试样外，均按 测定步骤进行。质控试验每次测定均应做一个用空白样品添加药物混合标样的质控样品，添加浓度应为相应产品的检测低限。结果计算 标准曲线的绘制将个浓度的标准溶液（、）和待测溶液按限量法测定步骤测定得相应的吸光度值。以浓度的吸光度值为分母，其他标准浓度的吸光度值为分子的比值，再乘以 ，获得吸光度的百分比。以此吸光度百分比为纵坐标，对应的个标准浓度为横坐标，在半对数坐标上绘制标准曲线。该定标模型在 范围内是线性的。百分吸光度值的计算按式（）计算百分吸光度值：百分吸光度值样品 （）样品 样品孔的平均吸光度值；零标准的平均
7、吸光度值。待测溶液中目标物含量的计算将样本的百分吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上得到相应的药物浓度（），按式（）计算血浆和尿液中新霉素药物的残留量。（）式中：试样中药物残留量，单位为微克升（）；从标准曲线中得到的试样中药物含量，单位为微克升（）；试样稀释倍数；计算结果保留三位有效数字。阳性结果需要经过 方法进行确认。犛犖犜 方法性能指标 灵敏度本方法在检测猪、牛、羊的血液和尿液样本中检测限为 。回收率本方法在 添加浓度水平上的回收率为 。精密度对于定量分析，每个试样最少应取两份平行样进行分析。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的。注：可使用经合格评定的等效的商
8、品化 试剂盒检测。第二方法液相色谱串联质谱方法试剂材料 水：规定的一级水。甲醇：色谱级。乙腈：色谱级。磷酸：优级纯。甲酸：色谱级。甲酸铵：色谱级。庚烷磺酸钠：色谱纯。磷酸三钠：分析纯。提取液：磷酸盐缓冲液（含 庚烷磺酸钠、磷酸三钠），磷酸调。提取液：磷酸盐缓冲液（含 庚烷磺酸钠、磷酸三钠）。柱：。仪器和设备 液相色谱质谱串联仪：配有电喷雾离子源，公司。均质器：，公司。涡旋混匀器。计：，梅特勒。高速冷冻离心机：。固相萃取仪：带正压空气泵，公司。移液枪：、。犛犖犜 测定步骤 提取按照 制备样品，从中取 至 离心管中，加入 提取液（），混匀震荡 、离心 ，上清液至另一新的 离心管中，加入 正已烷，振
9、荡混匀 ，离心，弃去上层液体，准确移取下层提取液 至一新的 离心管中，用提取液（）调节 ，待过柱净化。净化柱净化，提前用甲醇、水预柱，调节好的提取液加贮液器中以小于等于 的流速通过 柱，待液体完全流出后，用水淋洗小柱，弃去所有流出液，正压吹干，最后用甲醇洗脱，收集洗脱液至 聚四氟乙烯圆底离心管，水浴氮气吹干，流动相定溶过 滤膜至进样小瓶，供高效液相色谱串联质谱仪测定。测定 液相色谱条件 色谱柱：，：。流动相：有机相：乙腈；水相：甲酸水溶液（含 甲酸铵）梯度洗脱条件参见附录。流速：。柱温：。进样量：。质谱条件 离子化模式：电喷雾电离正离子模式（）。质谱扫描方式：多反应监测（）谱图参见附录。分辨率
10、：单位分辨率。其他质谱条件参参见附录。定性测定被测组分选择个母离子，个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与基标准溶液的保留时间偏差在之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的基质标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度 允许的相对偏差 定量测定在仪器最佳条件下，对基质标准工作溶液进样，以峰面积为纵坐标，基质标准工作溶液浓度为横坐犛犖犜 标绘制标准工作曲线，用标准曲线定量。空白试验除不加试样外，均按上述操作步骤进行。结果计算与表述外标法定量，试样中被测组
11、分残留量按式（）计算：犡犆犞 （）犡 试样中被测组分残留量，单位为微克每千克，；犮 从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升，；犞 试样溶液定容体积，单位为毫升，；试样溶液所代表的质量，单位为克，；注：计算结果应扣除空白值。测定低限、回收率和精密度 测定低限本方法对新霉素的测定低限为 。回收率和精密度尿液、血液中新霉素的回收率为 。非商业性声明：本标准文本中所用仪器型号仅为提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准的使用者尝试使用不同的厂家或型号的仪器。犛犖犜 附录犃（资料性附录）酶联免疫检测试剂的配制犃 的氢氧化钠溶液：称取 氢氧化钠，用容量瓶定容，溶解。犃 磷酸二氢钠缓冲液（）：取
12、磷酸二氢钠（），加水适量使成 后，用磷酸调至。犃 碳酸盐包被缓冲液（）：称取 、，加水定容至 ，溶解后置于冰箱保存。犃 稀释缓冲液 ：，吐温 （），混匀。犃 封闭缓冲液溶液：，加 牛血清白蛋白，溶解混匀。犃 洗涤缓冲液：含 磷酸钠缓冲液，加入 吐温 。犃 辣根过氧化物酶标记偶联物稀释液：含 磷酸钠缓冲液，加入 吐温，牛血清白蛋白。犃 底物液：过氧化氢，浓度为。犃 显色剂液：用 乙酸钠柠檬酸缓冲液配制 的四甲基联苯胺溶液。犃 终止液：硫酸溶液。犃 三个试剂的说明：样品提取液为美国提供、抗体为绵羊源新霉素多抗、偶联物为驴抗绵羊二抗。犛犖犜 附录犅（资料性附录）液相色谱的梯度洗脱条件步骤运行时间（）流速（）流动相（）流动相（）犛犖犜 附录犆（资料性附录）标准品多重反应检测（犕犚犕）色谱图犛犖犜 附录犇（资料性附录）参考质谱条件犇 碰撞气压力：犇 气帘气压力：犇 雾化气压力：犇 辅助气压力：犇 电喷雾电压：犇 离子源温度：犇 去簇电压：犇 碰撞室出口电压：犇 其他质谱参数见表。表犇 主要参考质谱参数化合物名称定性离子对定量离子对去簇电压碰撞能量 犛犖犜
