1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5325.12020出口食品中食源性病毒定量检测数字 PCR 法第 1 部分：诺如病毒Digital PCR method for quantitative detection of foodborne viruses in export foodsPart 1:Norovirus2020-12-30 发布2021-07-01 实施ICS 67.050CCS X 04中华人民共和国海关总署发 布SN/T 5325.12020I前 言SN/T 52352020出口食品中食源性病毒定量检测 数字 PCR 法为系列标准，分为 7 个部分。第 1 部分：诺
2、如病毒；第 2 部分：甲型肝炎病毒；第 3 部分：轮状病毒；第 4 部分：札如病毒；第 5 部分：星状病毒；第 6 部分：柯萨奇病毒；第 7 部分：脊髓灰质炎病毒。本部分为 SN/T 52352020 的第 1 部分。本部分根据 GB/T 1.12009 给出的规则编写。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国北京海关、中华人民共和国上海海关。本部分主要起草人：曾静、徐蕾蕊、魏海燕、马丹、印丽萍、黄新新、何宇平、蒋原。1SN/T 5325.12020出口食品中食源性病毒定量检测 数字
3、PCR 法 第 1 部分：诺如病毒1 范围本部分规定了贝类、硬质表面食品、生食蔬菜、软质水果等食品中诺如病毒的数字 PCR 检测方法。本部分适用于贝类、硬质表面食品、生食蔬菜、软质水果等食品中诺如病毒的定量检测。本方法所能达到的检测限为 1 800 拷贝/2 g（贝类消化腺）；1 800 拷贝/100 cm2（硬质表面食品）；3 600 拷贝/25 g（生食蔬菜和软质水果）。本方法所能达到的定量限为 3 600 拷贝/2 g（贝类消化腺）；3 600 拷贝/100 cm2（硬质表面食品）；7 200 拷贝/25 g（生食蔬菜和软质水果）。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而
4、构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析试验用水规格和试验方法。3 术语、定义和缩略语下列术语和定义适用于本文件。3.1 检测限 limit of determination（LOD）方法所能检测样品中最低的诺如病毒基因含量。3.2 定量限 limit of quantification（LOQ）在相对标准偏差不超过 25%的条件下，方法所能定量检测的样品中最低诺如病毒基因含量。3.3 微反应体系 tiny reaction system将含有模板、引物/探针、Ta
5、q 酶及其缓冲液充分混匀后分配至体积相同且相互物理隔离的油包水液滴或其它微孔、微室中所形成的小体积荧光 PCR 反应体系。2SN/T 5325.120203.4 过程质控物质 process control通过添加与目的病毒类似的外源质控物质如 MS2 噬菌体，来监测整个检测过程，通过对最终过程质控物质回收率的计算来评估检测过程的有效性和计算样品中病毒的实际含量。3.5 外部控制 RNA external control RNA(EC RNA)外源阳性对照 RNA，作为数字 PCR 过程的阳性对照。3.6 有证标准物质 certified reference material附有权威机构出具的
6、证书，说明使用程序，获得具有相关不确定度和溯源性的一个或多个特性值的标准物质。3.7 缩略语3.7.1 NV（Norovirus）：诺如病毒。3.7.2 PC（process control）：过程质控。3.7.3 EC RNA（external control RNA）：外源控制 RNA。3.7.4 PFU（plaque forming unit）：噬斑形成单位。4 原理数字 PCR（digital PCR）是在荧光 PCR 基础上发展起来的基因拷贝数定量检测技术，用于核酸模板的绝对拷贝数测定。通过将含有模板、引物/探针、Taq 酶及其缓冲液的荧光 PCR 反应体系充分混匀之后等量均分为相互
7、隔离的大数量（大于 10 000 个）微反应体系，使每个模板独立随机地分配至微反应体系中。所有微反应体系同时在相同的规定条件下进行 PCR 扩增反应后，根据设定的荧光阈值判断每个微反应体系的扩增结果。依据微反应体系的阳性率和泊松分布公式计算得到数字 PCR 反应体系中的模板浓度。5 设备及材料5.1 数字 PCR 系统：包括微反应体系发生器或其他具有同样功能的仪器、微反应体系荧光检测仪或其他具有同样功能仪器的系统。5.2 核酸定量仪：Nanodrop3 000 或 Modulus 检测仪或其他核酸定量检测仪。5.3 冷冻离心机。5.4 生物安全柜。5.5 低温冰箱：-80 冰箱，-20 冰箱。
8、5.6 天平：感量为 0.1 g。5.7 均质器。5.8 涡旋振荡仪。5.9 高压灭菌锅。3SN/T 5325.120205.10 恒温孵育器/箱：控温精度 1.0。5.11 微量移液器：100 L1 000 L、20 L200 L、10 L100 L、0.5 L10 L、0.1 L2.5 L。5.12 数字 PCR 微反应体系生成联排管及覆膜或芯片。5.13 网状过滤袋：400 mL。5.14 无菌棉拭子。5.15 无菌剪刀。5.16 无菌钳子。5.17 无菌培养皿。5.18 无 RNase 和 DNase 污染的玻璃容器。5.19 无 RNase 离心管、无 RNase 移液器吸嘴、无 R
9、Nase 药匙、无 RNase PCR 薄壁管。6 试剂所有实验用试剂均为分析纯，符合 GB/T 6682 的要求；除特别说明外，实验用水为无 RNase 超纯水。6.1 一步法数字 RT-PCR 反应预混液。6.2 果胶酶：来源于黑曲霉（Aspergillus niger）或棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）。6.3 PC 物质，制备及定量方法见附录 A。6.4 EC RNA：制备及定量方法见附录 B。6.5 Tris/甘氨酸/牛肉浸膏（TGBE）缓冲液：见 C.2.2。6.6 5PEG/NaCl 溶液：见 C.2.3。6.7 磷酸盐缓冲液（PBS）：见 C.2.4。6.
10、8 氯仿/正丁醇混合液：见 C.2.5。6.9 蛋白酶 K 溶液：见 C.2.6。6.10 75%乙醇：见 C.2.7。6.11 Trizol 试剂：见 C.2.8。6.12 引物和探针：根据表 1 的序列合成引物和探针，加入无 RNase 超纯水配制成 10 mol/L 浓度。扩增序列参见附录 D。表 1 数字 PCR 检测的引物和探针病毒名称引物和探针序列（方向 5-3）扩增片段大小（bp）参考毒株基因序列号及扩增基因位置G 型NVCOG1-F（正向引物）：CGY TGG ATG CGN TTY CAT GACOG1-R（反向引物）：CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA
11、CRING1-P（探针）：FAM-AGA TYG CGR TCY CCT GTC CA-BHQ185GenBank 登录号：AB621909.1，（657-741）G 型NVCOG2-F（正向引物）：CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AGCOG2-R（反向引物）：TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACARING2-P（探针）：FAM-TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT-TAMRA98GenBank 登录号：KX586330.1，（4 999-5 096）MS2噬菌体MS2-TM3-F（正向引物）：GGC TGC TCG CGG AT
12、A CCCMS2-TM3-R（反向引物）：TGA GGG AAT GTG GGA ACC GMS2-TM3-P（探针）：VIC-ACC TCG GGT TTC CGT CTT GCT CGT-BHQ1202GenBank 登录号：JF 719743.1，（3 135-3 336）注 1:简并引物：核苷酸链中除出现正常的 A、T、G、C 四种碱基符号外还出现如 R、Y、N 其他字母，其中R=A/G，Y=C/T，N=A/C/G/T，W=A/T。注2：荧光标记：FAM、VIC代表荧光报告基团，BHQ1代表荧光猝灭基团，反应过程中应选择相应的荧光通道。4SN/T 5325.120207 检测程序诺如病
13、毒数字 PCR 定量检测程序见图 1。图 1 诺如病毒数字 PCR 定量检测程序8 操作步骤8.1 质控物质的选取8.1.1 PC 物质选择 MS2 噬菌体或其他等效物质作为 NV 检测的 PC 物质。体外培养获得准确的效价（浓度），达到 108 pfu/mL1011 pfu/mL，分装后保存于-80。使用时稀释至 107 pfu/mL109 pfu/mL。8.1.2 EC RNA以含有 G型 NV 和 G型 NV 检测目的片段的 RNA 作为检测的 EC RNA，-80 保存。也可购买含有 NV 检测目的片段 RNA 的有证标准物质。8.2 不同食品基质中的病毒富集8.2.1 软质水果8.2
14、.1.1 将 25 g 软质水果或生食蔬菜切成约 2.5 cm2.5 cm2.5 cm 的小块（如水果或蔬菜小于该体积，可不切）。8.2.1.2 在软质水果或生食蔬菜表面添加 10 L PC 物质，室温静置吸附 30 min。8.2.1.3 将样品小块移至带有 400 mL 网状过滤袋的样品袋，加入 40 mL TGBE 溶液（软质水果样品，需加入 30 U A.niger 果胶酶或 1 140 U A.aculeatus 果胶酶）。8.2.1.4 室温下 60 r/min，振荡 20 min。酸性软质水果需在振荡过程中，每隔 10 min 检测 pH，如 pH5SN/T 5325.12020
15、值低于 9.0 时，使用 1 mol/L NaOH 调 pH 值至 9.5，每调整一次 pH 值，延长振荡时间 10 min。8.2.1.5 将振荡液转移至50 mL离心管，4，10 000 r/min,离心30 min。上清液转移至干净离心管中，用 1 mol/L HCl 调 pH 至 7.0。8.2.1.6 加入 0.25 倍体积 5PEG/NaCl 溶液，摇匀，4 过夜或 60 r/min 振荡 60 min。4，10 000 r/min，离心 10 min 紧实沉淀，弃上清液，加入 500 L PBS 悬浮沉淀。8.2.1.7 对于浆液过多的部分软果类样品，PBS 重悬后，加入 500
16、 L 的氯仿-正丁醇，涡旋混合，室温下孵育 5 min，4，10 000 r/min，离心 15 min，取上清液用于提取 RNA。8.2.2 硬质表面食品8.2.2.1 向硬表面食品表面添加 10 L PC 物质，添加面积不大于 100 cm2，室温静置吸附 30 min。8.2.2.2 将无菌棉拭子使用 PBS 湿润后，用力擦拭食品表面（100 cm2）。记录擦拭面积。8.2.2.3 将棉拭子浸入 490 L PBS 缓冲液中，按压无菌棉，如此重复浸入和挤压 3 次4 次，确保挤压出最大量的病毒，测定并记录液体 mL 数，用于后续 RNA 提取。8.2.3 贝类8.2.3.1 戴上防护手套，使用无菌贝类剥刀打开至少 10 个贝类。8.2.3.2 使用无菌剪刀、手术钳或其他等效器具在胶垫上解剖出贝类软体组织中的消化腺，置于干净培养皿中。收集 2.0 g 0.2 g 消化腺。8.2.3.3 向收集的消化腺中添加 10 L PC 物质，室温静置吸附 30 min。8.2.3.4 使用无菌刀片或等效均质器将消化腺匀浆后，转移至离心管。加入 2.0 mL 蛋白酶 K 溶液，混匀。8.2.3.
