1、以正式出版文本为准I C S0 7.1 0 0.3 0C C SX 0 4中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 5 1 6.1 32 0 2 3 出口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换核酸扩增(R A A)检测方法第1 3部分:蜡样芽孢杆菌R e a l-t i m e r e c o m b i n a s e-a i d a m p l i f i c a t i o n d e t e c t i o n m e t h o d f o r p a t h o g e n s i n e x p o r t f o o dP a r t 1 3:B a c i l l u s
2、c e r e u s2 0 2 3-0 5-0 5发布2 0 2 3-1 2-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件是S N/T 5 5 1 6 出口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换核酸扩增(R AA)检测方法 的第1 3部分。S N/T 5 5 1 6已经发布了以下部分:第1部分:沙门氏菌;第2部分:志贺氏菌;第3部分:金黄色葡萄球菌;第4部分:副溶血性弧菌;第5部分:克罗诺杆菌属;第6部分:大肠埃希氏菌O 1 5 7;第7部分:产志
3、贺毒素大肠埃希氏菌;第8部分:空肠弯曲菌;第9部分:单核细胞增生李斯特氏菌;第1 0部分:小肠结肠炎耶尔森氏菌;第1 1部分:肺炎克雷伯氏菌;第1 2部分:铜绿假单胞菌;第1 3部分:蜡样芽孢杆菌;第1 4部分:产气荚膜梭菌;第1 5部分:霍乱弧菌;第1 6部分:创伤弧菌。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国石家庄海关、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国西安海关。本文件主要起草人:刘立兵、孙晓霞、员丽娟、申进玲、王建昌、项佳林、王金凤、姜彦芬、陈敏娜。S N/T5 5 1 6.1
4、32 0 2 3以正式出版文本为准以正式出版文本为准出口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换核酸扩增(R A A)检测方法第1 3部分:蜡样芽孢杆菌1 范围本文件规定了出口食品中蜡样芽孢杆菌的荧光重组酶介导链替换核酸扩增(R AA)检测方法。本文件适用于出口食品中蜡样芽孢杆菌的快速筛选。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B 4 7 8 9.1 4 食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验 G B/T 6 6 8 2
5、 分析实验室用水规格和试验方法 G B 1 9 4 8 9 实验室 生物安全通用要求 G B/T 2 7 4 0 3 实验室质量控制规范食品分子生物学检测3 术语、定义和缩略语3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。实时荧光 R A A r e a l t i m e R A A R AA是一种核酸恒温扩增技术,在恒温下(一般为3 7 -4 2),重组酶和寡核苷酸引物结合形成蛋白-D NA复合物,该复合物能够移动寻找模板D NA中的同源序列,在单链D NA结合蛋白的帮助下,打开模板D NA的双链结构,在D NA聚合酶的作用下,形成新的双链,产物呈指数级扩增。在e x o探针中包含一个四
6、氢呋喃残基(TH F),其两侧分别为d T-荧光基团(F AM)和d T-淬灭基团(B HQ-1)。探针3 端通过适当的修饰(C 3 S p a c e r)被封闭,以阻止聚合酶的进一步延伸。只有当探针和目的D NA结合后,核酸外切酶I I I(E x o n u c l e a s e I I I,E x o I I I)能够识别并切除TH F残基,并解除3 端阻断,荧光基团和淬灭基团分开并产生荧光信号,R AA产物与荧光信号的增长存在对应关系。3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。B HQ 1:黑洞淬灭基团1(b l a c k h o l e q u e n c h e r 1)D N
7、A:脱氧核糖核酸(d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d)d NT P:脱氧核糖核苷三磷酸(d e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e)E x o I I I:核酸外切酶 I I I(E x o n u c l e a s e I I I)F AM:6-羧基荧光素(6-c a r b o x y f l u o r e s c e i n)1S N/T5 5 1 6.1 32 0 2 3以正式出版文本为准 P E G:聚乙二醇(p o l y e t h y l e n e
8、g l y c o l)R AA:重组酶介导链替换核酸扩增(r e c o m b i n a s e-a i d a m p l i f i c a t i o n)T r i c i n e:三(羟甲基)甲基甘氨酸(N-T r i s(h y d r o x y m e t h y l)m e t h y l g l y c i n e)1 6S r RNA基因:细菌核糖体1 6 S r R NA亚基基因4 技术概要 以提取的D NA为模板,采用蜡样芽孢杆菌特异性R AA引物和e x o探针,进行实时荧光R AA的扩增,根据实时荧光R AA的增幅情况,实现对食品中蜡样芽孢杆菌的快速筛选。5
9、 试剂和材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂,实验用水符合G B/T 6 6 8 2一级水的要求。所有试剂均用无D NA酶污染的容器分装。5.1 检测用引物(对)序列和探针 根据蜡样芽孢杆菌1 6S r RNA基因设计的上下游引物和一条e x o探针,详见表1。表1 引物和探针序列名称序列(5 -3)目的基因上游引物1 6S r RNA-FA T A C C C T G G T A G T C C A C G C C G TAAA C G A T G AG下游引物1 6S r RNA-RC AA C A T C T C A C G A C A C GA G C T G A C G A C
10、 AA C C Ae x o探针1 6S r RNA-PC TAAG T G T T A GA G G G T T T C C G C C C T T TA G T G C-T(F AM)-(TH F)-AAG-d T(B HQ 1)T AA C G C A T T AA G C-C 3 S p a c e r1 6S r RNA基因5.2 试剂5.2.1 细菌D NA提取试剂盒。5.2.2 R AA反应缓冲液:2 0%P E G。也可采用等效的商品试剂盒。5.2.3 2 8 0 mm o l/L乙酸镁。5.2.4 冻干酶制剂:1 mm o l/L d NT P、9 0 n g/L单链结合蛋白
11、、1 2 0 n g/L r e c A重组酶、3 0 n g/L B s u D NA聚合酶、3 0 n g/L E x o I I I,1 0 0 mm o l/L T r i c i n e、5 mm o l/L 二硫苏糖醇、1 0 0 n g/L肌酸激酶,保存于2 0 0 L反应管中冻干。也可采用等效的商品试剂盒。5.2.5 阳性对照:蜡样芽孢杆菌标准菌株,或含目的片段的D NA。6 仪器和设备6.1 荧光检测仪:具有恒温(3 9 1)扩增功能的荧光检测仪。6.2 微量移液器:1 0 0 L-1 0 0 0 L,2 0 L-2 0 0 L,1 0 L-1 0 0 L,0.5 L-1 0
12、 L,并配备与移液器匹2S N/T5 5 1 6.1 32 0 2 3以正式出版文本为准配的吸头。6.3 高速台式离心机:离心力1 2 0 0 0g。6.4 恒温金属浴:1 0 0 1。6.5 天平:感量0.0 1 g。7 检测程序 食品中蜡样芽孢杆菌实时荧光R AA检测程序见图1。图1 食品中蜡样芽孢杆菌实时荧光R A A检测程序8 操作步骤8.1 样品制备、增菌培养 按照G B 4 7 8 9.1 4的方法进行样品制备和增菌。8.2 细菌模板D N A的制备8.2.1 增菌液模板D N A的制备 对于8.1获得的增菌液,吸取1 m L菌液加入1.5 m L离心管中,1 2 0 0 0g离心
13、2 m i n,弃上清。采用试剂盒中的细菌悬浮液重悬细菌,并按照细菌D NA提取试剂盒说明书制备模板D NA。3S N/T5 5 1 6.1 32 0 2 3以正式出版文本为准8.2.2 可疑菌落模板D N A的制备 对于分离到的可疑菌落,可直接挑取可疑单菌落于1 0 0 L无菌水混匀,沸水浴1 0 m i n,立即置冰上冷却,1 2 0 0 0g离心2 m i n,上清液即为模板D NA。也可使用等效的商品化细菌D NA提取试剂盒并按其说明书制备模板D NA。8.3 实时荧光R A A扩增8.3.1 实时荧光R A A反应体系 蜡样芽孢杆菌R AA检测,5 0 L反应体系见表2。表2 蜡样芽
14、孢杆菌实时荧光 R A A反应体系组分名称体积 LR AA反应缓冲液2 5 1 6S r RNA-F(1 0 m o l/L)2.1 1 6S r RNA-R(1 0 m o l/L)2.1 1 6S r RNA-P(1 0 m o l/L)0.6D NA模板(2 0 n g/L)4.0无菌双蒸水1 3.7 乙酸镁(2 8 0 mm o l/L)2.5总量5 0 注1:D NA模板量可根据不同样品,具体情况进行调整。注2:将除乙酸镁和模板D NA以外的所有成分涡旋混匀,分装混合液至含有冻干酶制剂的2 0 0 L反应管中,轻柔手弹使冻干粉充分重溶均匀,短暂离心,打开反应单元,向每个反应单元的管盖
15、上加入2.5 L乙酸镁,然后向各反应单元加入模板D NA,充分混匀并离心。注3:可使用等效的商品化荧光R AA试剂盒按照其说明书进行检测。8.3.2 反应条件 将反应管置于荧光检测仪中,3 9,2 0 m i n。在反应过程中实时监测荧光信号。8.4 实验对照 检测过程中分别设空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照以无菌水代替模板D NA。阴性对照以非蜡样芽孢杆菌标准菌株D NA代替模板D NA。阳性对照制备:用棉签挑取新鲜生长于营养琼脂平板上的蜡样芽孢杆菌标准菌株至0.8 5%生理盐水中,调至麦氏浊度0.5左右,1 2 0 0 0 g离心2 m i n,弃上清;加入1 m L 0.8 5%无
16、菌生理盐水重悬沉淀,1 2 0 0 0g离心2 m i n,弃上清;加入1 0 0 L无菌水混匀后沸水浴1 0 m i n,立即置冰上冷却;1 2 0 0 0g离心2 m i n,上清液即为蜡样芽孢杆菌R AA反应的阳性D NA模板。4S N/T5 5 1 6.1 32 0 2 3以正式出版文本为准9 结果判定9.1 质控标准以下要求需在同一次实验中同时满足,否则,本次实验无效,需重新进行:a)空白对照:在2 0 m i n内无扩增曲线。b)阴性对照:在2 0 m i n内无扩增曲线。c)阳性对照:在1 0 m i n内出现典型的扩增曲线。9.2 结果描述及判定9.2.1 样品在2 0 m i n内无扩增曲线,可判定样品结果为阴性,可直接报告未检出蜡样芽孢杆菌。9.2.2 样品在2 0 m i n内出现扩增曲线,则样品结果为蜡样芽孢杆菌初筛阳性。对于初筛阳性结果,应按照G B 4 7 8 9.1 4进行确证。1 0 生物安全和防污染措施 为了保护实验室人员的安全,应由具备资格的工作人员进行检测,所有培养物和废弃物应按照G B 1 9 4 8 9中的有关规定执行。防止污染措施应符合G B
