1、以正式出版文本为准I C S6 7.1 8 0C C S X1 1中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 5 2 2.82 0 2 3 食用淀粉植物源成分鉴别方法 实时荧光P C R法第8部分:小麦淀粉I d e n t i f i c a t i o n o f p l a n t d e r i v e d m a t e r i a l s i n e d i b l e s t a r c h e s r e a l-t i m e P C R m e t h o d P a r t 8:W h e a t s t a r c h2 0 2 3-0 5-0 5发布2 0 2
2、3-1 2-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件是S N/T 5 5 2 2 食 用 淀 粉 植 物 源 成 分 鉴 别 方 法 实 时 荧 光P C R法 的 第8部 分。S N/T 5 5 2 2已经发布了以下部分:第1部分:红薯淀粉;第2部分:木薯淀粉;第3部分:马铃薯淀粉;第4部分:藕淀粉;第5部分:葛根淀粉;第6部分:山药淀粉;第7部分:玉米淀粉;第8部分:小麦淀粉;第9部分:绿豆淀粉;第1 0部分:豌豆淀粉。请注意本文件的
3、某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国上海海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国合肥海关。本文件主要起草人:邓婷婷、陈颖、韩建勋、邢冉冉、王娉、余晓峰、张九凯、杨娟。S N/T5 5 2 2.82 0 2 3以正式出版文本为准引 言 淀粉掺假损害了消费者的利益,扰乱了市场,对淀粉应用产生很大负面影响。为此,有必要建立快速、特异性好、灵敏度高的食用淀粉植物源性成分的检测方法。实时荧光P C R检测方法以其方便、快速、准确等特点,从基因水平分析原料和产品的来源与特性,特异性强、灵敏度高,在食品种类鉴
4、别、产地溯源等食品真伪鉴别研究中得到了广泛应用。该系列标准的制定及推广为保障食用淀粉的质量,保护消费者知情权和选择权,维护正常的经济秩序等提供了技术支持。所建立的方法可应用于农业系统、质量技术监督局、食品加工生产企业等单位,具有巨大的经济和社会效益,将为我国检验技术的提高和社会进步做出积极的贡献。S N/T 5 5 2 2 食用淀粉植物源成分鉴别方法 实时荧光P C R法 包括以下部分:第1部分:红薯淀粉;第2部分:木薯淀粉;第3部分:马铃薯淀粉;第4部分:藕淀粉;第5部分:葛根淀粉;第6部分:山药淀粉;第7部分:玉米淀粉;第8部分:小麦淀粉;第9部分:绿豆淀粉;第1 0部分:豌豆淀粉。S N
5、/T5 5 2 2.82 0 2 3以正式出版文本为准食用淀粉植物源成分鉴别方法实时荧光P C R法第8部分:小麦淀粉1 范围本文件规定了食用淀粉及其制品中小麦植物源成分的实时荧光P C R鉴别方法。本文件适用于食用淀粉及其制品中小麦成分的定性检测。本文件所规定方法的检出限(L O D)为1%(质量比)。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法G B/T 1 2 1 0 4
6、淀粉术语G B/T 2 7 4 0 32 0 0 8 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3 术语、定义和缩略语G B/T 1 2 1 0 4界定的术语和定义适用于本文件。4 方法提要提取样品D NA,以小麦D NA为阳性对照,以其他淀粉植物D NA为阴性对照,无菌水作为空白对照,使用小麦特异性引物和探针进行实时荧光P C R扩增,观察实时荧光P C R的增幅现象判定是否存在小麦成分。5 试剂和材料除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合G B/T 6 6 8 2中一级水的规格。所有试剂均用无D NA酶污染的容器分装。5.1 检测用引物和探针小麦成分扩增引物和探针、内参照引物
7、和探针详见表1。小麦引物扩增的靶标序列参见附录A。1S N/T5 5 2 2.82 0 2 3以正式出版文本为准表1 小麦成分鉴定用引物和探针序列名称引物/探针序列(53)扩增片段长度靶基因内参照正向引物:T C T G C C C TA T C AA C T T T C GA T G G T A反向引物:AA T T T G C G C G C C T G C T G C C T T C C T T探针:F AM-C C G T T T C T C A G G C T C C C T C T C C G G AA T C GAA C C-T AMR A1 3 7 b p1 8 S r RNA
8、小麦正向引物:C AA C AA T T T T C T C A G C C C C AA C A反向引物:T T C T T G C A T G G G T T C A C C T G T T探针:F AM-T T C C C G C AG C C C C AA C AA C C G C-T AMA R1 2 1 b pG A G 5 6 D 注:F AM和T AMA R可以用其他等效荧光基团替代。小麦成分扩增引物和探针引用自S N/T 1 9 4 32 0 0 7标准。5.2 三氯甲烷(氯仿)。5.3 异丙醇。5.4 C T A B提 取 缓 冲 液:2 0 g/L C T A B,1.4
9、 m o l/L N a C l,0.1 m o l/L T r i s-HC l,0.0 2 m o l/L N a 2 E D T A,p H 8.0。5.5 C T A B沉淀液:5 g/L C T A B,4 0 mm o l/L N a C l。5.6 7 0%乙醇(体积分数)。5.7 N a C l溶液(1.2 m o l/L)。5.8 蛋白酶K(2 0 m g/m L)。5.9 实时荧光P C R反应混合液(/1 2.5 L):1 U2 U(U n i t,酶学单位)的T a q酶、2P C R b u f f e r、2.5 mm o l/L4.0 mm o l/L的M g2+
10、、0.2 U1 U的UNG酶、0.2 mm o l/L的d(A,C,G)T P s、0.2 mm o l/L0.4 mm o l/L d UT P、4 0 0 n m o l/L R O X染料(某些荧光P C R仪不需要R O X校正)。6 仪器设备6.1 实时荧光P C R仪。6.2 恒温水浴锅。6.3 离心机:转速1 2 0 0 0 g。6.4 微量移液器:0.5 L1 0 L,1 0 L1 0 0 L,2 0 L2 0 0 L,2 0 0 L1 0 0 0 L。6.5 恒温混匀仪。6.6 涡旋震荡器。6.7 p H计。6.8 天平:感量0.0 1 g。7 检测步骤7.1 D N A提取
11、将样品研磨至粉末(淀粉样品直接称取),取1 0 0 m g2 0 0 m g于2 m L离心管中,加入1.5 m L C T A B提取缓冲液和1 0 L蛋白酶K溶液。6 5 振荡2 h,1 2 0 0 0 g离心1 0 m i n,转移上清液至一洁净2 m L离心管中。加入7 5 0 L氯仿后涡旋振荡,1 2 0 0 0 g离心5 m i n,将上清转移到新的离心管中。加入2倍体积的C T A B沉淀溶液,室温静置1 h,1 2 0 0 0 g离心1 5 m i n,弃去上清。加入3 5 0 L 2S N/T5 5 2 2.82 0 2 3以正式出版文本为准1.2 m o l/L N a C
12、 l溶液将沉淀溶解,加入3 5 0 L氯仿,涡旋振荡混匀,1 2 0 0 0 g离心1 0 m i n。转移上清后加入0.8倍体积的异丙醇,混匀-2 0 放置1 h,1 2 0 0 0 g离心1 0 m i n,弃去上清。加入5 0 0 L 7 0%乙醇溶液洗涤沉淀,溶解于1 0 0 L 无菌水中,-2 0 保存。上述模板D NA均可用等效D NA提取试剂盒提取。D NA提取过程中以水代替样品设置提取空白对照。7.2 实时荧光P C R扩增7.2.1 实时荧光P C R反应体系实时荧光P C R反应体系见表2。表2 实时荧光P C R反应体系试剂体积实时荧光P C R反应混合液1 2.5 L正
13、向引物(1 0 m o l/L)0.5 L反向引物(1 0 m o l/L)0.5 L探针(1 0 m o l/L)0.5 LD NA模板(5 n g/L2 0 n g/L)5.0 L灭菌d d H2O6.0 L 按照表2配制小麦基因和内参照基因的反应体系。设置3个重复,以C t值平均值作为最终结果。检测过程中应分别设立阳性对照和阴性对照。用含小麦成分的样品D NA作阳性对照,不含小麦成分的样品D NA作阴性对照。7.2.2 实时荧光P C R反应程序5 0 2 m i n;9 5 预变性 1 0 m i n;9 5 1 5 s,6 0 1 m i n,4 0个循环。8 质量控制8.1 D N
14、 A提取有效性判定将含小麦成分的样品、不含小麦成分的样品和待测样品同步进行D NA的提取,使用内参照引物和探针对三者进行检测,都有F AM荧光信号检出,且F AM通道均出现明显的扩增曲线,C t值3 5.0,表明三者D NA提取均有效。否则D NA提取无效,应重新提取D NA,直至C t值3 5.0。8.2 P C R有效性判定空白对照:无F AM荧光信号,相应C t值4 0.0。阴性对照:无F AM荧光信号,相应C t值4 0.0。阳性对照:有F AM荧光信号,且F AM通道出现明显的扩增曲线,C t值3 5.0。否则判定为P C R无效。9 检测结果判定在符合8.1和8.2的情况下,使用小
15、麦特异性引物和探针对被检样品进行检测:3S N/T5 5 2 2.82 0 2 3以正式出版文本为准a)如有F AM荧光检出,且C t值3 5.0,则判定样品含有小麦源性成分,表述为“检出小麦成分”;b)如C t值4 0.0,则判定为不含小麦源性成分,表述为“未检出小麦成分”;c)如3 5.0C t 4 0.0,则应重复实验,若再次扩增后的C t值仍4 0.0,且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常,则判定该样品含有小麦源性成分;若再次扩增后C t值4 0.0,且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常,则判定该样品不含小麦源性成分。1 0 检测过程中防止交叉污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施
16、应按照G B/T 2 7 4 0 32 0 0 8中附录D的规定执行。4S N/T5 5 2 2.82 0 2 3以正式出版文本为准附 录 A(资料性)小麦成分的基因扩增靶标参考序列(G A G 5 6 D基因)C AA C AAT T T T C T C AG C C C C AA C AA C AAT T C C C G C AG C C C C AA C AA C C G C AA C AAT C AT-T C C C C C AA C AA C AA C C A C C G T T C AT T C AG C C AT C T C T A C AA C AA C AG G T GAA C C C AT G C AAGAA 注:下划线标记处为引物探针位置。5S N/T5 5 2 2.82 0 2 3以正式出版文本为准参 考 文 献1 S N/T 1 9 4 32 0 0 7 小麦中转基因成分P C R和实时荧光P C R定性检测方法S N/T5 5 2 2.82 0 2 3以正式出版文本为准以正式出版文本为准320282255T/NS中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准食用
