1、G B/r 1 7 9 9 9.1-1 9 9 9前台 本标准以我国建立的H I 方法为基础，参照美国S P A F A S 公司的有关操作规程，规定厂S P F鸡红细胞凝集抑制试验。S P F鸡微生物学质量控制国家系列标准包括S P F鸡微生物学监测总则和 9 种S P F鸡微生物学检测方法本标准为 S P F鸡红细胞凝集抑制试验。S P F鸡微生物学检测方法还包括以下部分:G B/T 1 7 9 9 9.2-1 9 9 9 S P F鸡血清中和试验;G B/T 1 7 9 9 9.3-1 9 9 9 S P F鸡血清平板凝集试验;G B/T 1 7 9 9 9.4一 1 9 9 9 S P
2、 F鸡琼脂扩散试验;G B/T 1 7 9 9 9.5-1 9 9 9 S P F鸡酶联免疫吸附试验;G B/T 1 7 9 9 9.6-1 9 9 9 S P F鸡胚敏感试验;G B/T 1 7 9 9 9.7-1 9 9 9 S P F鸡鸡白痢沙门氏菌检验;G B/T 1 7 9 9 9.8 1 9 9 9 S P F 鸡 试管凝集试验;G B/T 1 7 9 9 9.9-1 9 9 9 S P F 鸡 间接免疫荧光试验。本标准由中华人民共和国农业部、国家科学技术部提出。本标准山农业部畜牧兽医司归日 本标准起草单位:农业部实验动物研究中心、山东省农科院家禽研究所。本标准土要起草人:陈德威、
3、赵立红、靳彦华、张秀美、李军。中华人民 共和国国家标 准S P F鸡红细胞凝集抑制试验H e m a g g l u t i n a t i o n i n h i b i t i o n t e s tG u/r 1 7 9 9 9.1-1 9 9 9S PF c hi c k e n1 范围 本标准规定厂 红细胞凝集抑制试验所用试剂、材料，操作程序及结果判定等 本标准适用于S P F鸡感染以下病原微生物后的血凝抑制抗体监测:禽流感病毒(A型)(A v ia n I n-f l u e n z a V i r u s(T y p e A)D.传染性支气管炎病毒(I n f e c t i o
4、 u s B r o n c h i t is V i r u s)，新城疫病毒(N e w c a s t l eD i s e a s e V i r u s),X腺病毒I 群(减蛋综合症)(A v i a n A d e n o v i r u s G r o u p 1 1),A毒支原体(My c o p l a s m aG a l l i s e p t i c u m)，沿液囊支原体(My c o p l a s ma S y n o v i a e)。2 原理 许多 病毒井有凝集动物红细胞的能力。这种凝集红细胞的能力 能被特异性抗体所抑制，因此可 用已知病毒检测相应的血凝抑制性
5、抗体3 试剂和器材3.1 试剂3 门门血凝抗原3.1.2 阴性、阳性血清3.13 被检血丫 青31.4 鸡红细胞11.5 0.8 5 0 o 生理盐水3.1.6 阿氏液3.2 器材3.2.1 9 s T L 微杖血凝板(U 型)。3.2.2 微I fr 移液器(T D t o I d一2 0 0 k )及吸头12.3 水浴锅。32.4 r=3 匕机与锥形刻度离心管4 操作程序4.飞 抗原血凝效价测定41.1 1 0%和().5 乡 石 鸡红细胞液的制备4.1.1-1 采鸡血:用 注射器 吸取阿氏 液约1 m 工 一 取3 口 龄一 功日 龄S P F 鸡(最少 两只)，从胸骨 尖下方约!.3
6、c m处 将注射器针头刺入 心脏.吸取心血约2 m l,-,t m 工，与 阿氏 液轻轻混合，放入 装有1 0 m l.阿氏液的离心竹中4.1.1.2 洗 涤 鸡 f 1_ LM 胞:将离 心 管中 的 血 液 经1 5 0 0 r/m i。一 8 0 0 r/m i n 离 心8 m in,弃上 清 液，沉淀兰 I t1l1 鲤 Ll:R,鱼 型丝IGl 二 q?立5 0(竺竺二8 0 0 竺m in,丝 二m in,9 1 1些 P 达上 lN R丝.Ya:燮国 家 质 量 技 术 监 督局1 9 9 9 一 们一 1 0 批准2 0 0 0 一 0 4 一 0 1 实 施C B/r1 7
7、 9 9 9，1 一1 9 9 9胞 几 层的自细胞薄膜，再重复以仁 过程后，加入阿氏液20m l，轻轻混合成红细胞悬液，4 保存s d 备用4 门门.3 1。%鸡红细胞悬液:取阿氏液保存不超过s d的红细胞液，在锥形刻度离心管中离心1 5 0。:/m m 一1 8()0r/m ins m t n，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积(m l _)，加人9 倍体积(。1)的生理盐水.用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞均匀混合4 门门.4 0.5%鸡红细胞液:取棍合均匀的10%鸡红细胞悬液 l m l，加入19m l生理盐水，混合均匀即可4 门.2 抗原血凝效价r)llJ定4.，.2 门于微
8、址血凝板的八 一G排各孔加入生理盐水5。川 一，Hl 与H l 孔作为对照，也加入生理盐水5 0科 14.1.2.Z A 一G排的第1 孔加入抗原5。产 L，每一种抗原的血凝效价测定应作两排检验，如A l 与B，孔各加入新城疫病毒抗原刘川;C l 与D，孔各加入禽流感病毒(A型)抗原5。拜 L，以此类推。4 门.2.3 用微量移液器，从第1 孔至第2孔对抗原作系列倍比 稀释，即将第1 孔的抗原与生理盐水用移液器反复吹吸3 次，吸出5()川 移至第2 孔，用生理盐水清洗吸头3 次后，再用于下一个孔的混合，以此类推，直至第12孔，从第飞 2 孔中吸出50户 L弃去，此孔抗原的最终稀释度为1，4 o
9、 9 6。4 门.2.4 仔孔巾加入。.5。似鸟 红细胞悬液50可，包括H l 与H I:孔。4 门.2.5 将血凝板置振荡器上中速振荡l m in 一Z r ni n。4.1.2.6 跪宝温(8 一2 2 )感作4 5 m i n4.1.2.了 抗原血凝效价判定:感作完毕.观察血凝板，判读结果(见表1)表 1 血凝试验结果判读标准井别红细胞全部凝集，均匀铺了:孔底，即1 00%红细胞醚集红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈红细胞J“孔底形成中 等大的圈，四周有小凝块红细胞于孔底形成小圆汽，四周有少许凝集块红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细胞完全不凝集 结果+十 十+十 弓-斗-一一一 能
10、使红细胞完全凝集(1 00写凝集，+)的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位。注意对照孔应呈现完全不凝集(一)，否则此次检验无效。4.2 血凝抑制试验4.2.1 被检血清样品准备4.2 门门而清灭活:被检血清，包括阳性、阴性血清，56C 水浴30m in45m in，以破坏补体及血凝抑制因 子。4.2.1.2 血清的鸡红细胞吸收:检测禽腺病毒 皿 群(E D S)时.分别吸取被检血清与对照血清样品3()()川 于 试管中，加入1()%鸡红细胞悬液3 0()川 一，轻轻混匀，室温(1 8 C 一22)感作30m i n，离心2 5 0 O r/m i nl )n，;n.此血清稀
11、释度为1:24，2.2 抗原准备 作血凝抑制试验时各种抗原所用血凝单位:禽流感病毒(A型)8 个与4个血凝单位 传染性支气管炎病毒8 个与4 个血凝单位 新城疫病毒16个与8 个血凝单位 禽腺病毒孤 群8个与4 个血凝单位 鸡毒支 原体8 个与4 个血凝单位 滑液做寺原休8个与 4 个血凝单位G B/T 1 7 9 9 9.1-1 9 9 9 8 个血凝单位抗原的配制:如果某抗原的血凝效价为1:1 0 2 4,8 个血凝单位为1 0 2 4/8=1 2 8即1:1 2 8)，取生理盐水 1 1.8 m l,加入 1:1 0 稀释的抗原 1.0-1-,混合均匀即为1:1 2 8 稀释液。4.2.
12、3 抗原血凝效价的重测定4.2.3.1 为了确证血凝抑制试验时使用抗原的活性，有必要对已配制的8个血凝单位抗原进行血凝效价的再测定，此项试验常与血凝抑制试验同时进行4-2-3-2 A至H各排第1 孔分别加入1 0 0 k 1.8 个IN If单位抗原(新城疫病毒抗原也加8 个血凝单位抗原，不要加 1 6 个血凝单位抗原)。4.2.3.3 各排第2-8 孔各加生理盐水5 0 1 A 14.2.3.4 将抗原分别作系列倍比稀释至第8 孔，从第8 孔吸5 0 1,1弃去42.3.5 每孔加0.5%鸡红细胞悬液5 0 I A L,4.2.3.6将血 凝 板置 微量 振 荡 器r_ 中 速振 荡1 m
13、i n-2 ra i n4.2.3.7 室温(1 8 C 一2 2 C)感作4 5 m i n 左右4.2.3.8 观察结果，若血凝单位偏离两个以上稀释度，则血凝抑制八验ti 效 若血凝单位偏离1 个稀释度，属可校正范围，按常规对被检血清的血凝抑制效价进行校止-4.2.4 血凝抑制试验4.2.4 门血 凝板每排检测一份被检血清 第1 孔分别加入经鸡红细胞吸收过 fi 被检血 清4 0 p 1，再加入生理t k 水6 0 1A 1;或加入其他未经红细胞吸收过的被检血清2 0 I d-f!加人生理盐水8 0 p L,姆孔的总体积为1 0 0 p L，被检血 清稀释度为l:5 o4.2.4.2 设阳
14、性血清与阴性血清对照。4-2.4-3 每排第2 孔分别加入5 0 p 1,8 个单 位抗原(新城疫病毒为5 0 I d-1 6 个 血凝单位抗原)，第3 1 7孔加5。p t 4 个单 位抗原(新城疫病毒为5 0 p L 8 个单位抗原)-4.2.4-4 用移液器自 第1 孔吹吸3 次后，取出5 0 p l移至第2 孔 以 此倍比 稀释下第1 1 孔，从1 1 孔吸出5 0 p 1弃去。4.2-4.5 第1 孔为血清对照，第2 孔被检血清为1:1 0 稀释，第3 孔 I:2 第4 孔1:4 0，以此类推，第1 1 孔为1:5 1 2 0 a4.2-4.6 每孔加入。.5%鸡红细胞悬液5 0 p t。42.4.7将血 凝板r7.微量振荡器上 振荡1 m i n 一 2 m m,4.2-4.8 r t-室温(1 8 C 一2 2 C)感作4 5 m i n 左右4.2-4-9 感作完毕，将血凝板倾斜7 0 0，凡沉淀于孔底的红细胞沿倾斜Ift i Ii7 下 呈线状流动，呈现与 红细胞对照孔 一 样者为完全不凝集孔。出现完全不凝集的血清最高稀释度为该被检血清血凝抑制效价5 结果判定禽流感(n型)、新城疫、传染性支气管炎、禽腺病毒N 群(E D S)的血清血凝抑制效价)1，1 0 为阳f;鸡毒支原体、滑液囊支原体的血清血凝抑制效价1:R。为阳性
