1、I C S 6 5.0 2 0.0 1一一B 21翰黔中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 G B J T 1 9 5 5 3-2 0 0 4 大豆种子品种鉴定实验方法 简单重复序列间区法 E x p e r i me n t a l i d e n t i f i c a t i o n me t h o d f o r v a r i e t y o f s o y b e a n s e e d-I S S R2 0 0 4-0 6-2 2发布2 0 0 4-1 2-0 1 实施 率 督骡 臀 瓣 譬 篷 臀 臀暴 发“G B/T 1 9 5 6 3-2 0 0 4 前 下翎本标准
2、的附录 A为规范性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出。本标准起草单位：国家农业标准化监测与研究中心（黑龙江）、黑龙江省质量技术监督局。本标准主要起草人：王庆贵、徐晶、姜雯、李光宇、石绍业、郝兆军。G B/T 1 9 5 6 3-2 0 0 4 引言 目前，我国农作物种子的鉴定多采用种植鉴定、快速测定法（苯酚染色法、大豆种皮愈创木酚染色法、高粱种子氢氧化钾一 漂白粉测定法、燕麦种子荧光测定法、小麦种子氢氧化钾测定法）、聚丙烯酞胺凝胶电泳法测定大麦、小麦种子纯度等。这些方法所需的检验周期较长，虽然电泳法所需时间短，但不具备分子水平鉴定的诸多优点。随着分子生物学的发展，特别是 2 0 世纪
3、9 0 年代以来，分子生物学的相关技术已被广泛应用，其检测对象为D N A大分子生物的遗传基础。以D N A为检测对象，具有许多其他检测水平所不具备的优点：首先，可供探测D N A标记的数量是无限的，这是同工酶技术所无法比拟的；其二，D NA分析技术不像其他技术那样随组织或发育阶段而异，植物体任何部位、任何时期提供的 D N A均可用于分析，其检测结果都是一样的；第三，D N A分析不受环境影响，其变异只源于等位基因 D N A序列的变异，这种稳定性便于揭示品种间的遗传变异，从而排除了环境变异所造成的表型变异。基于上述优点，D N A分析技术是农、林、牧、渔等品种鉴定的先进方法。G B/T 1
4、 9 5 6 3-2 0 0 4 大豆种子品种鉴定实验方法 简单重复序列间区法，范围 本标准规定了大豆种子品种鉴定的实验方法。本标准适用于利用简单重复序列间区（I S S R）法对大豆种子品种鉴定的实验过程。2 术语、定义和缩略语2.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。2.1.1 聚合酶链式反应 p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n 少至一个拷贝的特定碱基顺序的 D NA片断在体外花费几个小时即可扩增 出数百万个分子的酶催化反应，即D N A合成反应。2.1.2 简单皿复 序列间区 i n t e r-s i m p l e s e
5、 q u e n c e re p e a t 是在P C R技术基础上发展起来的一种分子标记和检测方法，根据某个简单重复序列（微卫星位点）设计出一系列特异引物，通过P C R反应扩增微卫星位点间隔的碱基顺序，以检测其扩增片段长度的多态性。2.1.3 徽卫星 D N A m i c ros a t e l l i t e D N A 是一类 由几个核昔 酸（一般为 1 个 5 个）为重复单位 的长 达几 十至几百个核昔酸的串联重复序列。2.1.4 核昔酸n u c l e o t i d e 是构成核酸的基本单元，由三部分组成：五碳糖、磷酸和环状的含氮碱基2.1 5 引物p r i m e r
6、 一条互补结合在模板D N A链上的短的 单链，提供3 -O H末端作为D N A合成的起点，延伸合成模板 D N A的互补链。2.1.6 引 物扩增多 态性 p r i m e r a m p l i f i e d 州y m o r p h i s m 一对引物在两个或两个 以上不 同材料基 因组 D N A之间扩增，得到数 目不同或长度不同的 D N A片断。2.2 缩略语 下列缩略语适用于本标准。I S S R 简单重复序列间区（I n t e r-S i m p l e S e q u e n c e R e p e a t)P C R 聚合酶链式反应（P o l y m e r a
7、 s e C h a i n R e a c t i o n)D N A 脱氧核糖核酸（D e o x y r i b o n u c l e i c A c i d)G B/T 1 9 5 6 3-2 0 0 4 R N A核糖核酸（R ib o n u c le i c A c i d)O D光密度（O p t ic a l D e n s i t y)T B E 三经基氨基甲烷一 硼酸一 乙二胺四乙酸二钠（T r i s B o r ic-a c i d E D T A)3 实验方法3.1 原理 D N A是生物体的遗传基础，携带所有的遗传物质，从 D N A分子水平上进行鉴别是区分物种
8、、品种甚至个体之间差异最为有效的方法。利用P C R技术可将D N A片段在短时间内扩增几十甚至几百万倍，从而达到可以检测的目的。I S S R 方法是在P C R技术基础上发展起来的一种检测方法，是根据简单重复序列（微卫星位点）设计出一系列特异引物，包括双核昔酸、三核昔酸和四核昔酸等为重复单位的微卫星D N A片段（一般为2 0 个碱基），通过P C R反应扩增微卫星位点及其间隔区，以检测其扩增片段的多态性。3.2 环境条件 a）温度：1 5 0C-2 5 0C；b)湿度：相对湿度（R H）不大于 5 0 0 0 03.3 仪器 a)P C R扩增仪；b)紫外分光光度计；c）高速台式离心机：
9、转速不小于1 5 0 0 0 r/m i n;d)多用 电泳仪及水平式电泳槽；e)紫外透射仪；f)微量移液器：规格为0.1 p.L-2.5 p.I _,2 ji L -2 0 f A L,2 0 ju L-2 0 0 ji L,1 0 0 L L-1 0 0 0 p L;g）电子天平：分度值为。.0 0 0 1 g;h)磁力加热搅拌器；i)凝胶成像系统；j）超纯水系统；k）灭菌锅；1)酸度计：最大允许误差为士0.1 p H;m）微波炉；n）恒温水浴锅：最大允许误差为士1 0C;a)恒温干燥箱：最大允许误差为士1 0C o3.4 试剂和耗材3.4.1 试剂 a)T a g D N A聚合酶：保存
10、条件为一2 0 士2 0C；b)1 0 X B u f f e r：保存条件为一2 0 土2 0C；c）四种脱氧核昔酸（(4 X d N T P)：保存条件为一2 0 士2 1C;d)Mg t 十：保存条件为一2 0 士2 0C；e)R N A酶（无 D N A酶）：保存条件为一2 0 士2 0C；f）琼脂糖（a g a r o s e)；g）三经甲基氨基甲烷（T r i s)：分子式为C,Hn N O,;h）乙二胺四乙酸二钠（E D T A N a t 2 H 2 0)：分子式为 C i o Hi a N Z O a N a t.2 H 2 O;i)澳酚蓝（b r o m p h e n o
11、 l b l u e s o d i u m s a l t)：分子式为C,9 Hg B r,0 5 S N a;7）二甲苯青F F(x y l e n e c y a n o l e F F)：分子式为C 2 s H2 7 N 2 0 6 S 2 N a;G B/T 1 9 5 6 3-2 0 0 4 k)8-经基哇琳(h y d r o x y q u i n o li n e)：分子式为C,H,N O;1）十二烷基磺酸钠（S D S)：分子式为C 1 2 H 2 5 0,S N a;m)澳化乙锭(E B)：分子式为C 2 1 H 2 o N 3 B r;n）异戊醇：分子式为C,H l,O
12、 H;0）结晶酚(p h e n o l)：分子式为C,H,O，保存条件为一2 0 士2 0C;P）三抓甲烷：分子式为 C HC 1 3，纯度为分析纯；q)硼酸（b o r i c a c id)：分子式为H 3 B 0 3，纯度为分析纯；r）蔗糖（s u c r o s e)：分子式为C 1 2 H 2 2 0 1 1，纯度为分析纯；s)无水乙醉：分子式为 C Z H,OH，纯度为分析纯；t)盐酸：分子式为 HC 1，纯度为分析纯；u)抓化钠：分子式为 N a C l，纯度为分析纯；v)水：分子式为H 2 O。本实验所用水均为去离子水。3.4.2 耗材 a)离心管：规格为1.5 m L,O.
13、2 m L。使用前需进行高压灭菌（按第凡1 章中规定的方法进行操作）；b）研钵：规格为直径 7 c m-1 0 c m;c)移液器吸头：规格为2 0 ti L,2 0 0 p.L和1 0 0 0 p L。使用前需进行高压灭菌；d）容量瓶：规格为1 0 0 mL,1 0 0 0 mL;e）烧杯：规格为1 0 0 mL;f)三角烧瓶：规格为 2 5 0 m L;g)P E手套；h）锡箔纸；i）封 口膜。3.5 实验程序3.5.1 D N A的提取3.5.1.1 取大豆种子半粒，放在1.5 m L离心管中，加人1 0 0 0 p.L匀浆缓冲液（按第a2 章中规定的方法进行配制）浸泡4h，倒人研钵中充
14、分研磨，将研磨产物倒人1.5 m L离心管中，取少量匀浆缓冲液冲洗研钵，一并倒人离心管中，离心（转速为 4 0 0 0 r/m i n)1 0 m i n，将上清液移至新的 1.5 m L离心管中，弃沉淀。3.5.1.2 加人与上清液等体积的饱和酚（按第A.3 章中规定的方法进行配制），缓慢颠倒离心管2 0 m i n，避免剧烈振荡。3.5.1.3 离心（转速为8 0 0 0 r/m i n)1 0 m i n，将上清液移至新的离心管中。3.5.1.4 加人与上清液等体积的酚一 三氛甲烷一 异戊醇（体积比为2 4，2 3，1)，离心（转速为8 0 0 0 r/m in)1 0 min，将上清液
15、移至新的离心管中。3.5.1.5 加人与上清液等体积的三氛甲烷一 异戊醇（体积 比为 2 3，1)，缓慢颠倒 1 0 m i n，离心（转速为8 0 0 0 r/m i n)1 0 m i n，取上清液至新的离心管中。3.5.1.6 加人上清液二倍体积的冰冷乙醉，水平旋转离心管5 0 圈1 0 0 圈，即可出现白色絮状D N A,3.5.1.7 将离心管置于一2 0 冰箱中3 0 m in，取出后离心（转速为8 0 0 0 r/m in)1 0 m i n，形成白色沉淀。3.5.1.8 倒掉离心管中的液体，加人1 mL 7 5 乙醇，离心（转速为1 5 0 0 0 r/min)5 mi n，倒
16、掉乙醉，倒置在干净的吸水纸上，吸干液体。3.5.1.9 将离心管置于恒温干燥箱（4 0 0 C-5 0 0C）中2 0 m i n 或里于通风处4 0 m i n，使乙醉挥发。3.5.1.1 0 加人1 0 0 p L T E缓冲液（按第A.4 章中规定的方法进行配制）和R N A酶2 K L（按第A.5 章中规定的方法进行配制），水浴（5 5 士2 0C)1 2 h，使D N A沉淀充分溶解，4 冰箱中保存。G B/T 1 9 5 6 3-2 0 0 43.5.2 D N A浓度的检测3.5.2.1 策外吸收检测 D N A分子中的嗦吟环和啥陡环能够吸收紫外光。D N A的紫外吸收高峰在波长 2 6 0 n m处，蛋 白质的紫外吸收高峰在波长2 8 0 n m处。取3.5.1中提取的D N A溶液5 p L，加水9 9 5 I.L，放人比色杯中，用紫外分光光度计检测，记下2 6 0 n m和2 8 0 n m下的O D值，计算出D N A的浓度以及O D 6。和O D a o的比值。D N A的O 玖6 o/O D z a o 最好在 1.8 左右，1.5 以上也可用于I S S R
