1、G B/T 5 4 1 3.9-1 9 9 7前言 测定维生素A,D,E成分的相互干扰。的方法很多，但广为采用的是高压液相色谱法，方法快速、准确，并避免了三种本标准由中国轻工总会提出。本标准由 全国 乳品标准化中心归口。本标准负责起草单位:国家乳制品质量监督检验中心。本 标 准 参 加 起 草 单 位:卫 生 部 食 品 卫 生 监 督 检 验 所、浙 江 省 轻 工 业 研 究 所、哈 尔 滨 森 永 乳 品 有 限 公司、雀巢(中国)投资服务有限公司。本标准主要起草人:杨金宝、王芸。中华 人 民共 和 国 国 家标 准婴 幼 儿 配 方 食 品 和 乳 粉G s/T 5 4 1 3.9-1
2、 9 9 7维 生 素 A,D,E的 测 定Mi l k p o w d e r a n d f o r m u l a f o o d s f o r i n f a n t a n d y o u n g c h i l d r e n -De t e r mi n a t i o n o f v i t a mi n A,D,E c o n t e n t1 范围 本标准规定了用液相色谱法测定维生素A,D,E的方法。本标准适用于各种婴幼儿配方食品和乳粉中维生素A,D,E的测定。2 方法提要 样品中脂溶性维生素在皂化过程中与脂肪分离，经(用)石油醚萃取后，用高压液相色谱，紫外检测器定量测定
3、。3 试荆 所有试剂，如未注明规格，均指分析纯;所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。3.1 高峰氏淀粉酶(T a k a-D i a s t a s e),3.2 异丙醉:色谱纯。3.3 焦性没食子酸的乙醇溶液:1 5 g/L,3.4 氢氧化钾溶液:质量比为1 0 0 1 5 0,3.5 石油醚:沸程3 0 -6 0 0C,3.6 甲醇:色谱纯。3.7 正己烷:色谱纯。3.8 环己烷:色谱纯。3.9 维生素A,E标准溶液3.9.1 维生素A标准贮备液，含维生素A 1 0 0 t,g/m L的甲 醇溶液。称取1 0 m g 的维生素A，用甲 醉定容于1 0 0 m L容量瓶中。3.9.2
4、 维生素E标准贮备液，含维生素E 4 0 0 k g/m L的甲 醇溶液。称取4 0 m g 的维生素E，用甲 醉定容于1 0 0 m L容量瓶中。3.9.3 维生素A,E 标准工作液，其中 维生素A的浓度为2 p g/m L，维生素E的浓度为2 0 1,g/m L a 取1 m L维生素A标准贮备液(3.9.1)和2.5 m L维生素E标准贮备液(3.9.2)于5 0 m L容量瓶中，用甲醉溶解。3.1 0 维生素D标准溶液3.1 0.，维生素D:标准贮备液，含维生素D,1 0 0 p g/m L的甲醇溶液。称取1 0 m g 的维生素D,，用甲 醇定容于1 0 0 m L容量瓶中。3.1
5、0.2 维生紊D,标准贮备液，含维生素D,1 0 0 K g/m L的甲醇溶液。国家 技术 监件局1 9 9 7 一 0 5 一 2 8 批准1 9 9 8 一 0 9 一 0，实 施G B/T 5 4 1 3.9-1 9 9 7 称取 I o m g 的维生素D 3，用甲醇定容于 1 0 0 m L容量瓶中。3.1 0.3 维生素D标准工作液，其中维生素D z、维生素D:的质量浓度均为l a g/m L,取维生素D:标准贮备液1 m L,维生素D 3 标准贮备液I m L于l 0 0 m L容量瓶中，用甲醇定容。4 仪器 常用实验室仪器及:4.1 平底烧瓶:2 5 0 m L a4.2 分液
6、漏斗:5 0 0 m L,4.3 旋转蒸发器。4.4 高压液相色谱仪:具有可变波长的紫外检测器、数据处理系统或记录仪。5 操作步骤5 门样品处理5.1.，含淀粉的样品 准确称取l o g 样品，放人2 5 0 m L平底烧瓶中，加人1 g T a k a 淀粉酶(3-1)，再加入3 0 m L 4 5 5 0 C 的蒸馏水，混合 均匀后，用氮气排除瓶中空气，盖上瓶塞，置4 5 C 烘箱内3 0 m i n,5.1.2 不含淀粉的样品 准确称取l o g 样品，置于2 5 0 m L平底烧瓶中，加3 0 m L蒸馏水。5.2 测定液的制备5.2.1 于上述处理过的样品溶液中加人 1 0 0 m
7、L的没食子酸乙醇溶液0.3)，充分混匀后加5 0 m L氢氧化钾溶液(3-4)，在蒸汽浴上连续回流3 0 m i n 后，立刻冷却到室温。5.2.2中5.2.3将皂化液转入一5 0 0 m L分液漏斗中，用1 0 0 m L水分几次冲洗平底烧瓶，洗涤液并入分液漏斗于上述分液漏斗中，加入1 0 0 m L石油醚0.5)，盖好瓶塞，倒置分液漏斗并剧烈振摇l m i n。在振摇过程中，注惫释放瓶内压力。静置分层，将水相放入另一5 0 0 m L 分液漏斗中。重复上述萃取过程二次，合并醚液到第一个分液漏斗中。用蒸馏水洗该醚液至中 性，通过无水硫酸钠过滤干燥，在4 0 和氮气流下，于 旋转燕发 器上蒸
8、至近干(绝不允 许蒸干)后，用石油 醚转移至l O m L 容量瓶中，定容。5.2.4 从上述容量瓶中取2 m L石油醚溶液放入试管A中，再取7 m L石油醚溶液放入另一试管B中，分别用氮气将试管A和B中的石油醚吹干，石油醚溶液放于A中加5 m L甲醉，用来测定维生素A,E,试管B中加1 m L 正己 烷，用来测定维生素D,5.3测定5.3.1 维生素A和 E的测定5.3.1.1 仪器条件 色谱 柱:2 5 c m X 4.6 m m,O D S 柱或具等同 性能的 色谱柱。流动相:甲醇。流速:1.O m L/m in,灵敏度:0.0 0 5 A U/MV,波长;维生素A,3 2 5 n m;
9、维生素E,2 9 0 n m,5.3.1.2 注射5 0 V L 维生素A,E标样(3.9.3)和5 0 1A L 样品溶液(5.2-4 试管A中)，得到标样和样品溶液中维生素A和E的峰高或峰面积。5.3.2 维生素D的测定5.3.2.1 测定液的制备 a)仪器条件G B/T 5 4 1 3.9-1 9 9 7 色谱柱:3 0 c m X 4 m m，硅胶柱。流动相:环己 烷(3.7)与正己 烷(3.8)按体积比1 1 混合，并按体积分数0.8%加入异丙醉(3.2),流速:1 m L/m i n,波长:2 6 5 n m,柱温:2 0 0C.灵敏度:0.0 0 5 A U/M V.注射体积:2
10、00F-L.b)注射5 即L 维生素D标样和2 0 0 K L 样品 溶液(试管B中)，根据维生素D标样保留 时间收集维生素D于试管c中，将试管C用氮气吹干，准确加入。2 m L甲醇(3.6)溶解。5.3-2.2 测定步戮 a)仪器条件 色谱柱:2 5 c m X 4.6 m m,G。或具等同 性能的色谱柱。流动相:甲醉。流速:1 m L/m i n,柱温,2 0 r-.波长:2 6 5 n m,灵敏度:0.0 0 5 AU/MU.注射体积.5 0 y L.b)注射5 0,.L维生素D标准溶液(3.1 0.3)，注射5 0 p L 样品溶液(试管C中)，得到标样和样品溶液中维生素D峰面积或峰高
11、。6 分析结果的玻述样 品 中 维 生 素 A(I U/l o n g)一，止 生 1 0/2 全:5 X 3.卫之 卫 卫 旦样品中维生素E(I U/l 0 0 g)二c,X 1 0/2 X 5 X 1 0 0 m(2)样品中 维生 寒D(I U/1 0 0 8)A,c,X 1 0/7 5 X 1 0 0 X 4 0m X 1 0 0 0(3)A-X c 曰(4)式中:，进样液中维生素A,E或D的质量浓度，j a g/-L;二 样品的质量，9;人进样液中维生素A,E或D的峰高(或峰面积);A.e 标样中维生素AX或D的峰高(或峰面积);c.a-标样中 维生素A,E 或D的质量浓度，j a g/m L.计算结果精确至小数点后一位。了 允许理 同一样品的两次测定值之差，维生素A不得超过两次测定平均值的5%;维生素D不得超过两次测定平均值的1 0%;维生素E不得超过两次测定平均值的5%.
