1、5N 一 丫 苏 疼丫中华人民共和国进出口商品检验行业标准s N 0 1 6 8 一 9 2出 口食 品 平 板 菌 落 计 数P l a t e c o u n t f o r b a c t e r i a l c o l o n i e s i n f o o d f o r e x p o r t1 9 9 2 门 2 一 2 8 发布1 9 9 3 一 0 5 一 0 1 实施中华人民共和国国家进出口商品检验局发 布中华人民共和国进出口商品检验行业标准出 口食 品 平 板 菌 落 计 数s N 01 68 一 9 2P l a t e c o u n t f o r b a c t
2、e r i a l c o l o n ie s i n f o o d f o r e x p o r t代替Z B X 0 9 0 0 1-8 61 主题内 容与适用范围 本标准规定了出口 食品平板菌落计数的方法.本标准适用于各种出口食品及其原料，有专门规定检验方法的除外。2 设备和材料2.1 工作台:超净工作台或放于清洁、光线充足的实验室里的水平工作台。琼脂平板在工作台上暴露1 5 m i n，每平板不得超过 1 5 个菌落。2.2 恒温培养箱:3 6 士1。2.3 恒温水浴箱:4 5 士1。2.4 均质器。2.5 振荡器。2.6 吸管:1,1 0 和 2 5 mL，具。.1 mL刻度。
3、2.7 平皿:直径为 9 0 mm,2.8 稀释瓶:广口 瓶或 三角烧瓶，容量为2 0 0 m L 和5 0 0 m L,2.9 玻璃珠:直径为 5 m m左右。2.1 0 夭平:感量。.1 g,培养墓和试剂，平板计数琼脂。2 7 5%乙醇。3 稀释剂:磷酸盐缓冲稀释液。操作程序4.1 样品制备4.1.1.以无菌操作取有代表性的样品盛于 灭菌 容器内。如有包装，则用7 5%乙醇在 包装开口 处擦拭后取样。4.1.2 制备样品匀液4.1.2.1 固 体或 半固体食品:以无菌操作取2 5 g 样品，放人装有2 2 5 m L 稀释 剂的灭菌均质杯内，于8 0 0 0 r/m i n 均质1-V 2
4、 m i n，制成1:1 0 的样品匀液。如样品 均质时间超 过2 m i n，应 在均质杯外加冰水冷却。4.1.2.2 干燥或干粉食品;以 无菌操作取2 5 g 样品，放入装有2 2 5 m L稀释 剂和适量玻璃珠 的5 0 0 m l-稀释瓶中。迅速振摇，将样品 混匀，制成I:1 0 的样品匀液。振摇时，幅 度为3 0 c m,7 s 内 振摇2 5 次，也可用机械振荡器振荡 1 5 s 代替手摇。中华人民共和国国家进出口商品检验局1 9 9 2-1 2-2 8 批准1 9 9 3-0 5-0 1实施 Is N 016 8一 924.1.2.3 液体食品:用灭菌吸管吸取2 5 m L 样品
5、，放人装有2 2 5 m L稀释剂的5 0 0 m L稀释瓶中，按4.1.2.2 条中 所 述 方法 迅速 振 摇，制成1:1 0 的 样品 匀 液。吸 取 样品 时，吸管 插 入液 面下 不 要 超过2.S c m。吸管内液 体要在2 -4 s 内完 全排 入稀释剂中。不要在稀释剂中吹洗吸管。4.2 稀释样品匀液4.2.1 用1 0 m L灭菌 吸管准确吸 取1，1 0 的样品匀液1 0 m L，放入装有9 0 m L 稀释剂的2 0 0 m L 稀释瓶中。按4.1.2.2 条中 所述的方法，迅速振摇。制成1:1 0 0 的样品液。从容器中吸取样品匀 液和以后的 稀释操作中，吸管尖不要碰着瓶
6、口。吸入的液体应先高于所要求的 刻度，然后提起吸管使 其尖端离开液面 并贴在容器内 壁将液体调至 所要求的 刻度。4.2.2 分别用 1 0 mL灭菌吸管按4.2.1 条所述方法将样品匀液制成 1 0 倍递增稀释的样品液，如1 0-,1。一 ,1 0-s.4-3 平板接种4.3.1 对于每一个样品，选用合 适的三个连续 稀释度的样品 液进行平板计数。4.3.2 分别用灭菌吸管吸取 1 mL样品液放入作了适宜标志的平皿内。每个稀释度的样品液用两个平皿。如果某一样品液在取出供试部分前的放置时间超过 3 min，应按4.1.2.2条所述方法再振摇该样品液。4.3.3 分别加 1 2 1 5 mL平板
7、计数琼脂(已放 4 5+1的水浴中恒温)到各平皿内。立即将平皿内的样品液和琼脂培养基充分混合。混合 方法是将 平皿倾 斜和旋转。要防止把混合物溅到平皿壁和盖上。同时 将 平 板 计 数 琼 脂 倾 入 加 有1 m L 稀 释 剂 的 另 一 灭 菌 平 皿 作 空 邮寸 照。将 样 品 液 加 入 平 皿 后 应 立 即 倾注琼脂培养基，每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过 2 0 mi n.l4.4培养 待 琼 脂 凝固 后 将 平 皿 翻 转，立 即 放 进3 6 士 1 的 恒 温 培 养 箱内 培 养4 8 士 2 h。培 养 箱 应 保 持 一 定 的湿度，经 4
8、 8 h培养的琼脂培养基的失重不得超过 1 5 肠。4.5 菌落计数和记录4.5.1 培养后，立即计数每个平板上的菌落数。2 5 -2 5 0 个菌落为合适范围。如果不能立即计数，应将平板存放于。4，但不得超过 2 4 h.4.5.2 如只有一个稀释度的两个平板上的菌落在合适范围内，先计算两个平板的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克(毫升)样品中平板菌落数(下表，样品 1),4.5.3 如有两个稀释度在合适范围内，先计算每个稀释度两个平板的 平均值，再计算两 个稀释度的平均值，然后计算每克(毫升)样品中平板菌落数(下表，样品2),4.5.4 当最低稀释度的两个平板上都少于2 5 个菌
9、落时，计数这一稀释度两个平板上的实际菌落数，计 ._.少、._ _算两个平板上的平均菌落数，将平均 菌落数乘以稀 释倍数，得到估计的平板菌落数。给 这个数注上星号(，)，表明该数系从菌落数 在2 5 2 5 0 这一范围 之外的平板估计 所得(下表，样品3)04.5.5 当所有平板上的菌落都超过 2 5 0 时，则应将最高稀释度的两个平板的平均菌落 数乘以稀释倍数，得到估计的平板菌落数。给这个数注上星号()(意义同4.5.4)(下表，样品4),4.5-6 如果所有稀释度的平板都没有菌落，则以小于1 乘以最低稀释倍数报告平板菌落数。给这个数注上星 号(，)(意义同4.5.4 条)(下表，样品5)
10、04.5.7 同一稀释度的两个平板中，一个有2 5-邓。个菌 落，另一个的菌落多于2 5 0 个，两个平板都要计数。计算方法同4.5.2 条(下表，样品6).4.5.8两 个 连 续 稀 释 度 中 的 每 个 稀 释 度 都 有 一 个 平 板 的 菌 落 数 在2 5.2 5 0 个 范 围 内，而 另 一 个 的 菌 落、数 高 于2 5 0 或 低 于2 5，四 个 平 板 都 要 计 数 计 算 方 法 参 照4.5.2 条 和4.5.3 条(下 表，样 品7)04.5.9 某稀释度的两个平板都有2 5 2 5 0 个菌落，而另一稀释度的两个平板中只有一个平板的菌落数在 2 5 2
11、5 0 范围内。四个平板都要计数，计算方法参照4.5.2 条和 4.5.3 条(下表，样品8,9),4.5.1 0 蔓延生长菌落s N 0 168 一 92 通常有三种不同类型的蔓延生长 菌落。第一种 类型 是链状菌落，菌落之间 没有明显界线。这些菌落是当琼脂和试验物混合时，一个细菌块被分散所致;第二种类型是在琼脂和平皿底 之间 形成的水膜样菌落;第 三种是在 平皿边缘或琼脂表面形成的水膜样菌落。如果所选择的平 板出 现过fi t 的蔓延菌落生长，以 致a.被蔓延菌落盖 住的 地方，包括由于蔓延菌落造成的抑制生 长区 面积超过平板面积的5 0%，或b.由 于蔓延菌落造成的抑制生长区面积超过平板
12、面积的2 5 0 o，这样的 平板报告为“蔓延菌落”，不予计数。计数其他平板上的菌落数，将这些数值的 算术平均值报告为平板菌落数(下 表，样品1 0),当有必要计数除以上 a.和b.外的蔓延生长菌落时，将三种不同类型的蔓延菌落分别计数。对于第一种类型，如果仅有一 条链，将它作为一个菌落计。如果有来源不同的几条链，将每条链作为一个菌落计，不要把链上生长的各个菌落分开来数。第二种和第三种类型的蔓延生长形成易于鉴别的菌落，即按一般菌落计数，把计数的蔓延生长菌落数同一般菌落数加在一起，计算平板菌落数。4.5.1 1 操作者对同一平板复核自 己的计数结果，其差异应在5%之内，而其他人对这一平板重复计数，
13、其差异应在1 0%之内。否则，应找出原因，加以 校正。46 计算和记录数字 适宜稀释度的两个平板的菌落数平均值或两个稀释度的平板菌落数平均值乘以相应稀释倍数计算出每克(毫升)样品中平板菌落数。记录时，只有在换算到每克(毫升)样品中平板菌落数时，才能定下两位有效数字，第三位数字采用四舍五入的方法记录。也可将样品的平板菌落数 记录为1 0 的指数形式(见 下表中的例子)5结果报告 报告每克(毫升)样品中平板菌落数或估计的平板菌落数。平板菌落数计算样 品 号菌落数平板菌落数/g(.L)脚1:1 0 0 1:1 0 0 0 1:1 0 0 0 01多不可计1 7 5 1 6多不可计2 0 8 1 71
14、 9 0 0 0 0(1.9 X 1 0 1)2多不可计2 2 4 2 5多不可计2 4 5 3 02 5 0 0 0 0(2.5 火 1 0 )31 8 2 01 4 0 01 6 0 0(1-6 X 1 0 )4多不可计多不可计5 2 3多不可计多不可计4 8 75 1 0 0 0 0 0(5.1 X 1 0 )50 0 00 0 0 1 0 0(1.0 火1 0 1)6多不可计2 4 5 2 3多不可计2 7 8 2 02 6 0 0 0 0(2.6 X 1 0 )S N 01 68 一 9 2续表样品号菌落数平 板菌落数/g(.L)1:1 0 0 1+1 0 0 0 1:1 0 0 0
15、 07多不可计2 2 5 2 1多不可计2 5 5 4 02 7 0 0 0 0(2.7 X 1 0 )8多不可计2 1 0 1 8多不可计2 4 0 2 82 3 0 0 0 0(2.3 又 1 0 1)9多不可计2 6 0 3 0多不可计2 3 0 2 82 7 0 0 0 0(2.7 X 1 0 )1 0多不可计2 4 5 3 5多不可计2 3 0蔓延菌落2 9 0 0 0 0(2.9 X 1 0 1)注:带星号(朴)者为估计数.s N 0 1 6 8 一9 2 附录A培 养 荃 制 备 (补充件)A 1 平 板计数琼脂 胰 蛋 白 陈 5.0 9 酵母浸膏2.5 g 葡萄搪1.0 g
16、琼 脂1 5.0 g 蒸馏水1 0 0 0 m L 将 各 成 分 加 于 蒸 馏 水 中，煮 沸 溶 解。分 装 试 管 或 烧 瓶,1 2 1 高 压 灭 菌1 5 m in。最 终 p H 7.0 士 0.1.A 2 磷 酸盐缓冲 稀释液贮存液:磷酸二氢钾(K H 2 P 0,)3 4.0 g蒸馏水用大约5 0 0 m L1 7 5 m L的 1 m o l/L氢氧化钠溶液调节 p H至7.2，用蒸馏水稀释至 1 0 0 0 m l后贮存于冰箱.稀释液:用蒸馏水稀释 1.2 5 ml贮存液至 1 0 0 0 m L，分装于合适容器,1 2 1高压灭菌 1 5 mi n.附加说明:本标准由中华人民 共和国国 家进出口 商品 检验局提出。本标准由中 华人民共和国河 南进出口 商品 检验局、湖南进出口 商品检验局负责 起草。本标准主要起草人李志培、邓明义。本标准主要参考美国食品和药物管理局(F D A)细菌学分析手册 第6 版第4 章(1 9 8 4 年)。
