1、SN中华人民共和国进出口商品检验行业标准s N 0 1 8 4 一 9 3 出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法Me t h o d f o r t h e e x a mi n a t i o n o f L i s t e r i a mo n o c y t o g e n e s i n f o o d s f o r e x p o r t1 9 9 3 一 1 1 一 0 5 发布1 9 9 4 一 0 5 一 0 1实施中华人民共和国国家进出口商品检验局发 布中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出 口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法s N 018 4一 93Me t h
2、 o d f o r t h e e x a mi n a t i o n o f L i s t e r ia mo n o c y t o g e n e s i n f o o d s f o r e x p o r t主题内容与适用范围本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法。本标准适用于牛乳、乳制品、水产品、肉及肉制品食品。其他食品可参照采用。原理 单核细胞增生李斯特氏菌是一种能引起人畜共患疾病的致病菌。在胰酪陈大豆酵母浸膏琼脂(T S A-Y E)、选择性培养 基(M M A)等平板上 用4 5 0 角斜射光照射可观察到蓝色菌 落;水解七叶普并与柠檬酸铁按反应产生黑色菌落
3、。设备和材料微生物学实验室常用设备。解剖镜。斜射灯。平面镜。培养基和试 剂33.1脚3.33444.1 培养基4.1.1 胰酪陈大豆酵母浸膏肉汤(T S B-YE)(见B I).4.1.2 胰酪陈大豆酵母浸膏琼脂(T S A-YE)见B 2),4.1.3 增菌培养液(E B)(见B 3).4.1.4 选择性培养基(MMA)(见B O.4.1-5 牛津琼脂(O X A)(见 B 5)o4.1.6 改良缓冲蛋白陈水(MB P)(见B O.4.1.7 7%羊血琼脂(见 B 7).4.1.8 糖发酵培养基(见B 8)o4.1.9 半固 体琼脂(见G B 4 7 8 9.2 8 中3.2 8 条)。4
4、门.1 0 尿素琼脂(见 G B 4 7 8 9.2 8 中2.1 5 条)。4.1.1 1 硝酸盐培养基(见G B 4 7 8 9.2 8 中2.1 7 条)。4.1.1 2 MR-V P培养基(见G B 4 7 8 9.2 8中2.4 条)。4.1.1 3 三糖铁琼脂(T S I)(见G B 4 7 8 9.2 8中3.2 4条)。中华人民共和国国家进出口商品检验局1 9 9 3-1 1 一 0 5 批准1 9 9 4 一 0 5 一 0 1 实施 IS N 0 1 8 4 一 9 34.2 试剂4.2.1 胰酪蛋白陈(或胰蛋白陈)。4.2.2 盐酸叮陡黄素。4.2.3 蔡陡酮酸。4.2.
5、4 复达新。4.2.5 甘氨酸醉4.2.6 氯化铿。4.2.7 苯乙醇。4.2.8 放线菌酮。4.2.9 多粘菌素 E.4.2.1 0 头抱双硫哇甲氧。4.2.1 1 磷霉素。4.2.1 2 柠檬酸铁钱。4.2.1 3 七叶昔。4.2.1 4 酚红。4.2.1 5 D-葡萄糖。4.2.1 6 D 一 甘露醇4.2.1 7 哥伦比亚琼脂。4.2.1 8 酵母浸膏。4.2.1 9 牛肉浸膏。5 检验步骤5.1 样品 如为冷冻食品，应于 2-5-C 解冻，且不超过 1 8 h;若不能及时检验，应置于一1 5 保存。非冷冻的易腐样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于4 冰箱保存，在 2 4 h之
6、内检验。5.2 前增菌和增菌5.2.1 前增菌:巴氏消毒乳、乳制品、冷冻水产品，冻肉及其它加工食品均应进行前增菌。无菌操作称取2 5 g 样品，加入装有2 2 5 m L 改良 缓冲蛋白 陈水(M B P)的 均质杯内，高速均质1-v 2 m i n制成1,1 0 样品匀液，转入 5 0 0 m L广口瓶内;液体食品可用吸管吸取2 5 m L样品，加人装有 2 2 5 mL改良缓冲蛋白陈水(MB P)的广 口瓶内，充分振摇制成 1:1 0样品匀液，于 3 0 培养 1 8 2 4 h。移取 1 mL，转种于1 0 0 m l,增菌培养液(E B)内，于 3 0 C 培养 2 4,4 8 h，分
7、别进行分离。5.2.2 直接增菌:生乳、鲜肉 及未经加工处理过的样品 不必经过前增菌。检验时，以无菌操作取2 5 g(2 5 mL)样品，按前法所述，用 2 2 5 m L增菌培养液代替改良缓冲蛋白肪水制成 1:1 0 样品匀液，于3 0 培养 2 4 和 4 8 1,，分别进行分离。5.3 分离5.3.1 取增菌液一环，划 线接种于 选择性培养基(MM A或O X A)平板上，于3 5 培养2 4-4 8 h,5.3.2 斜射光镜检:将解剖 镜、斜射灯、平面镜，如图1 所示装置，使 光源以4 5 0 角 照射到平面镜上，再反射为解剖 镜光源。将MM A平板放在 解剖镜载物台 上，通过目 镜垂
8、直向下 观察，李斯 特氏菌菌落在 此平板上，呈现蓝 色或蓝灰色，扁平圆润，稍有凸起，边缘整齐，菌 落较小，约为。.5 m m左右。使用解 剖镜观察并挑取五个可疑菌落，划线 接种到胰酪陈 大豆酵母浸膏 琼脂(T S A-Y E)平板，于3 5 培养1 8 -2 4 h,纯培养后进行鉴定。黑色菌落观察 李斯特氏菌在O X A平板上生长 2 4 h后菌落呈黑色，直径为1 m m，在其周围形成一个黑色环。培养 4 811.菌落仍呈黑色，直径 2-3 m m，除在菌落周围有一环外，在菌落中心部位的深层也S N 01 84 一 9 3形成黑点。挑取五个可疑菌落.接种于T S A-Y E平板上，纯培养后进行
9、鉴定白 光 光源三 角架w面镜 图 1 斜射光镜检示意图5.4鉴定5.4.1 蓝色菌落检验;用 4 5 0 斜射光镜检 T S A-Y E平板上的蓝色菌落，如纯化不理想，可再次挑取可疑菌落于T S A-Y E 平板上培养，直至获得满意 结果为止。将纯化后的菌落接种于T S B-Y E肉汤，于 3 5 C培养 2 4 h，供生化等项 目 检验使用。5.4.2 典型运动镜检:在T S A-Y E平板上挑取生长良好的菌落于洁净载玻片上，用。.8 5%灭菌生理欲水制成悬浮液，压上盖玻片，于显微镜下用油镜观察，李斯特氏菌为短棒状杆菌，可见轻微的旋转及翻滚，这是该菌的典型运动特征。5.4.3 过氧化氢酶试
10、验:挑取 T S A-Y E平板上的菌落于洁净载玻片上，滴加 1滴 3%的过氧化氢(H B O:)溶液，李斯特氏菌呈过氧化氢酶阳性反应。5.4.4 革兰氏染色:按照常规方法进行革兰氏染色，李斯特氏菌呈革兰氏阳性反应。5.4.5 溶血试验:将7%羊血琼脂平板底面划分为 2 0-2 5 个小格，每格刺种一个菌落。从每个T S A-Y E平板上至少挑取 2 个菌落刺种血平板，并刺种阳性对照菌(单核细胞增生李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌)，于3 5 C培养2 4 -4 8 h。于明亮处进行观察，单核细胞增生李斯特氏菌和西尔李斯特氏 菌在刺种点周围 产生窄小的透明p 型溶血环;绵羊李斯特氏菌
11、有大的 透明俘 型 溶血环;其他李斯特氏菌种不产生溶血环。5.4.6 尿素酶试验:用T S B-Y E肉汤培养物穿刺接种于尿素琼脂斜面上，于 3 5 C 培养5 d,逐 日观察，李斯特氏菌呈尿素酶试验阴性反应，斜面无颜色变化。5.4.7 硝酸盐还原试验 用T S B-Y E肉汤培养物接种于硝酸盐肉汤中，于 3 5 C 培养 5d，加入。.2 mL试剂 A，再加入。.2 mL试剂B，轻摇混合。如在1-2 min内出现红色，判断为阳性反应;如果没有颜色显现，在含有试剂A和试剂B 的试管内 再加入少 量锌粉(约2 0 m g)，放置1 h，如出现红色，表示仍有 硝酸盐存在，未被细菌还原，判断为阴性。
12、5.4.8 MR-V P试验 将T S B-Y E肉汤培养物接种于 MR-VP肉汤中，于 3 5 C培养4 8 h。移取 1 m1培养 物于洁净 试管中，加5%a-蔡酚溶液6 m 1，再加4 0 0 o 氢氧化钾溶液0.2 m L,轻轻摇动试管约1 m i n,静置约2 0 m i n，出 现红色为V P阳 性反应;将剩余培养液继续于3 5 培养2 d，加甲基红指示剂5 滴于试管中，出现红色为MR阳性反应。李斯特氏菌均为MR-VP阳性反应。S N 0 1 8 4 一9 35.4.9 三糖铁试验:用T S B-Y E肉汤培养物接种于三糖铁琼脂(T S ll，于 3 5 C 培养 5 d。李斯特氏
13、菌在斜面和底层 产酸，不产 硫化氢(H,S),5.4.1 0 糖发酵试验:将 T S B-YE肉汤培养物分别接种于。.5%葡萄糖、麦芽糖、七叶昔、甘露醇、鼠李糖、木糖发酵管内，于3 5 培养2 4 4 8 h阴 性继续培养 到第5 天，李斯特氏 菌不 产气，其不同菌种生 化反应见表 1,5.4.1 1 动力试验:将 T S B-Y E肉汤培养物垂直中心穿刺于半固体动力培养基，于室温(2 0 -2 5 C)培养 2 -5 d,逐日观察。李斯特氏菌有动力，在半固体试管内呈典型伞状生长，底部为弯月牙形。5.4.1 2 协同溶血作用试验(c A MP，又称环腺普酸试验):在羊血琼脂平板上各划一直线，使
14、两线平行，在两平行线上分别接种P 型溶血金黄色葡萄球菌(S.a u r e u s)和马红 球菌(R.e q u i)培养物，在该两线之间垂直划线接种待测菌培养物，与两线相近但不相交，于3 5 C 培养 2 4.4 8 h后.观察相交处溶血情况。单核细胞增生李斯特氏菌(L.m o n o c y t o g e n e s)和西尔李斯特氏菌(L.s e e l i g e r i)在靠近金黄色葡萄球菌接种点附 近的 溶血增强，绵羊李斯特氏菌(L.i v a n o v i i)在 靠近马红球菌 接种点附近的溶血增强，可见有明显的箭头状溶血现象;其他李斯特氏菌不产生溶血。5.4.1 3 血清学检
15、验:将 T S B-Y E肉汤培养物接种到 3 mL T S B-Y E肉汤中，于 3 5 培养 2 4 h;接种2 支 T S A-Y E琼 脂斜面，于3 5 培养2 4 h;用3 m L 0.0 1 m o l/L磷 酸盐缓冲液将斜面菌苔洗下，菌悬液于8 0 C 水溶中加热1 h，以2 5 0 0 r/m i n 离 心3 0 m i n，弃去2 m L 上清液，将剩余液与沉淀混匀制成菌悬液，进行血清学玻片凝集试验。5.4.1 4 小鼠 毒力试验:将分离的菌株接种到1 0 m L T S B-Y E肉汤中，于3 5 培养2 4 h，将1 0 m L 培养物全部转移到离心管中，以 2 5 0
16、 0 r/mi n 离心 3 0 mi n，弃去上清液，用1 m l的。8 5%灭菌生理盐水制成菌悬液(此时的浓度约为1 0 0 个菌/m L),腹腔注射体重为1 6 1 8 g 小鼠，每只注射。1 m L，约注入1 0，个菌，每 组5 只，观察7 d 内 小鼠 死亡情况。用已 知致病的单核细 胞增生李斯特氏 菌和非致病的英诺克李斯特氏菌的菌株按同法进行，做对照试验。报告结果6.1 协同溶血作用试验、血清学试验和动物试验可根据需要进行;常规检验可不进行这些试验。检验程序见附录A(补充件)。6.2 单核细胞增生李 斯特氏 菌与其他李斯特氏 菌种的鉴别见表1,表 1 李斯特 氏菌菌种鉴别特征注:v反 应 不 一 定.S N 018 4 一 9 3表 2 李斯特氏菌菌种的主要鉴别特征中文菌名原 名血 清 型溶血试验石 肖酸土卜工口工还原糖发 醉c A M P试 验小 鼠毒 力试 验甘露醉鼠李搪木糖金黄色葡萄球菌马 红球 菌单核细胞增生李斯特氏菌L.mn n n c y t a g e n e s1/2 A,1/2 B,1/2 C3 A.3 B.3 C4 A,4 A B,4 B4 C 4 D,
