1、1SN中华人民共和国进出口商品检验行业标准s N 0 1 7 2 一 9 2出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法Me t h o d f o r d e t e c t i o n o f s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s i n f o o d f o r e x p o r t1 9 9 2 一 1 2 一 2 8 发布1 9 9 3 一 0 5 一 0 1 实施中华人民共和国国家进出口商品检验局发 布中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法S N 01 72一 92Me t h o d f o r d e t e c
2、t i o n o f s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s i n f o o d f o r e x p o r t代替 Z B X 0 9 0 0 3一 8 61 主题内容与适用范围 本标准规定了出口食品中金黄色葡萄球菌的检验方法。本标准适用于出口食品的检验。2 设备和材料2.1 供常规平板计数用的基本设备与材料。2.2 1)形玻璃棒。3 培养基和试剂普通肉汤培养基。胰蛋白脉大豆肉汤。B a i r d-P a r k e r 培养基甲苯胺蓝-D NA琼脂。生理盐水。凝固酶试验兔血浆。J胜.门了内，曰，呢月，反J户卜d，J内j月工J，d样品制 备
3、4.1 固体或半固体 食品:以无菌操作称取2 5 g 样品，放入装有2 2 5 m L 灭菌生理盐水的灭菌 均质 杯内，于8 0 0 0 r/m i n均质 1-2 m i n，制成 1 e 1 0样品匀液。4.2 液体食品:用灭菌吸管吸取 2 5 m L样品，放入装有 2 2 5 m L灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内(瓶内预段适当数量的玻璃珠).经充分振摇制成 1:1 0 徉品匀液。4.3 供汁数检验时，可按 进位递增稀释法将样品匀液再进行适当稀释。检验步骤5.1 最近似值(MP N)测定法 适用于检测认为带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的食品中的少星金黄色葡萄球菌。5.1 门选三个连续稀
4、释度，从每 个稀释度分别取 1 mL稀释样品液，接种3管含 l o y,X化钠胰蛋白陈大豆肉 汤。样品的最高稀释度必须达到能获得阴性终点，置3 6 士1 C 培养4 8 h5.1,2 用3 mm接种环，从有细菌生长的各管中移取 1 环 划线接种于表面干燥的B a i r d-P a r k e r 琼脂平板，置3 6 士1 C培养 4 5 -4 8 h,5.1.3 从有细菌生长的每一平板上至少挑取 1 个可疑金黄色葡萄球菌菌落 见附录 B(参考件)，移种中华人民共和国国家进出口商品检验局，9 9 2-1 2-2 8批准1 9 9 3-0 5-0 1 实施 IS N 017 2一 92到肉汤培养
5、基中，置 3 6 士1培养2 0 2 4 h,5.1.4 取肉汤培养物。.3 mL同0.5 mL凝固酶试验免血浆于8 m m X 1 0 0 mm试管内充分混合，置3 6士1培养，定时观察是否有凝块形成，至少观察 6 h，以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流动者为阳性。试验中需同时做已知阳性和阴性对照。对可疑结果，应进行革兰氏染色、镜检和其他辅助试验 如耐热核酸酶试验 见附录C(补充件)等 加以证实。5.1.5 报告结果 根据凝固酶试验结果查最近似值(MP N)表 见附录 D(补充件)，报告金黄色葡萄球菌的 MP N/g(mL)o5.2 平板表面计数法 适用于检查金黄色葡萄球菌数不小于1
6、0/g(m L)的食品。5.2.1 选三个连续稀释度，从每个稀释度分别取 1 mL稀释样液，接种至 3 个表面干燥的B a i r d-P a r k e r琼脂平板上(如 0.4 ml.-0.3 m l,-0.3 mL)e5.2.2 以L形玻璃棒将接种物涂布于琼脂表面，避免涂到平板边缘，将平板正置直至接种物被培养基吸收，将平 板翻转,3 6 1 1 培养4 5 4 8 h,5.2.3 挑选有 2 0 2 0 0个菌落的平板进行计数。如果有数种菌落皆类似金黄色葡萄球菌，则分别计算和记录每一类型的菌落数。当最低稀释度的平板的菌落数小于2 0 时，仍可选用。如平板上的菌落数大于 2 0 0，其中有
7、些菌落具有典型金黄色葡萄球菌的外观，同时在其高倍稀释度未出现典型菌落者，亦可用这些平板进行金黄色葡萄球菌计数，但不能把非典型菌落计算在内。5.2.4从可计数的各类型菌落中至少各选取1个菌落，参照 5.1.3-5.1.4 条进行凝固酶试验。报告结 果 将呈凝固酶阳性的菌落所代表的 3 个平板上的菌落数相加，并乘以样品稀释倍数，即以此数报告为所检查食品中 的金黄色 葡萄 球菌 数/g(m L)e5.3 非选择性增菌法 适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品取 1:”稀释的样品液 1 0 m L，接种于1 0 mL双料胰蛋白陈大豆肉汤中，3 6 士1 C培养2 h,再加入 2 0 mL含 2
8、 0%氯化钠的单料胰蛋白陈大豆肉汤,3 6 士1培养 2 4 士2 卜。取上述培养物。2 mL，分别涂布于2个表面干燥的 B a i r d-P a r k e r 琼脂平板上,3 6 士1 C培养4 6从每个平板上至少挑取 1个可疑金黄色葡萄球菌菌落.参照 5.1.3-5.1.4 条进行凝固酶试验报告结果1。L。工Jh月亡qJ勺J，Jn白住J，J55.乐士55如发现有凝固酶试验阳性的菌落，即报告 1 g(mL)食品中有金黄色葡萄球菌存在，否则为阴性。S N 01 72 一 9 2 附录A培 养 荃 和 试 剂 (补充件)A 1 普通肉汤培养墓 成分:牛 肉膏氯化钠蛋白陈蒸馏水5.0 g5.0
9、 g2 0.0 g1 0 0 0.0 m L 制法:将以上 成分混合 加热溶化，调至p H 7.4 7.6，分装试管，1 2 1 高压灭菌3 0 m i nA Z 胰蛋白膝大豆肉汤 成分:胰蛋白陈植物蛋白陈氯化钠磷酸氢二钾(K 2 H P O,)葡萄糖蒸馏水1 7.0 g3.0 g5.0 g2.5 g2.5 g1 0 0 0.0 mL 制法:将各成分溶于蒸馏水中，必要时加热使完全溶解，分装于试管或玻瓶中，1 2 1 C高压灭菌1 5 mi n，最终p H7.3 士0.2 注制备双料胰蛋白陈大豆肉汤时，除蒸馏水外，其他成分加倍，配制 1 0%或 2 0%氯化钠胰蛋白陈大豆肉汤时，可 将氯化钠量增
10、加至所需浓度。A 3 B a i r d-P a r k e r 培养基 成分:胰蛋白陈牛肉膏酵母膏丙酮酸钠甘氨酸氯化铿(L i C l 6 H,O)琼脂蒸馏水1 0.0 g5.0 g1.0 g1 0.0 g1 2.0 g5.0 g2 0.0 g9 5 0.0 mL 制法:将各成分加于蒸馏水中，加热煮沸使完全溶解，冷至2 5，调至p H 7。士0.2，分装每瓶9 5 mL,1 2 1 C 高压灭菌 1 5 m i n,临用时加热溶化琼脂，冷至5 0左右，于每 9 5,一 加入预热至 5 0 C的卵黄亚磅酸钾增菌剂 5 mL，摇匀后倾注平皿培养基，应是致密不透明的，使用前在冰箱贮存不得超过S N
11、 0 172 一 924 8 h 卵黄亚啼酸盐增菌 11 配制:将新鲜鸡蛋浸泡 在适当 的H g C I,溶液(1:1 0 0 0)中约1 m i n，以无菌操作 打开鸡蛋，使蛋黄与 蛋白分开，将蛋黄加于生理盐水中(3+7,V/V)充分摇匀，于5 0 m l，蛋黄乳液中加入 1 0 mL过滤除菌的 I%亚谛酸钾水溶液，混匀.4 士1 C贮存。A 4 甲苯胺蓝一 D N A琼脂 成分:脱氧核糖核酸(D N A)0.3 g 琼脂1 0.0 g 袄化钙(C a C 1。无水少1.1 m g 城化钠1 0.。g 甲苯胺蓝()，0.0 8 3 g _ 二经 甲基 氦 基 甲 烷6.1 g C Tr i
12、s(h y d r o x y me t h y U a r n in o me t h a n e)蒸馏水1 0 0 0.0 mL 制法:将三经甲基氨基甲烷溶解于蒸馏水中，调至 p H 9.0,除甲苯胺蓝(O)外将其余各项成分加热使溶解。再将甲苯胺蓝(O)溶于培养基中。分装于塞有橡皮塞的烧瓶中。如立即使用可不需灭菌已灭菌的培养基在室温可存放4个月无变化，并经数次熔化后仍可使用。A 5 生理盐水 成分:孩化钠蒸馏水5g0 0 0.0 m 1 制法:将诫化 钠溶于蒸馏水中，分装于适当容器中，1 2 1 C 高 压灭 菌1 5 m i nA 6 凝固酶试验免血浆 临用时取 3.8 鱿(取柠檬酸钠3
13、.8 g加蒸馏水 1 0 0 m工，待溶解后过滤.1 2 1(高压灭菌 1 5 mi n)柠檬酸钠1 份.加入所鲜兔血4 份，混匀后放冰箱中使用球沉降(或以3 0 0 0 r/mi n离心 3 0 min)后取上清液进 行试验 附录B典型或可疑金黄色葡萄球菌菌落 (参考件)金黄色葡萄球菌的单个菌落在 B a i r d-P a r k e r 琼脂平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润.直径 2 3 mm。灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色(非白色)的边缘，周围绕以不透明圈(沉淀)，其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样枯稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株，除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基
14、本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落，其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙.质地较 于 燥S N 01 72 一 92 附录C耐热核酸酶试验 (补充件)C 1 取3 mL甲苯胺蓝一 D NA琼脂平铺于载玻片上制成标本片。C 2 待琼脂凝固后，在琼脂上打成直径 2 mm的小洞(每个载玻片 1 0-1 2个)，抽出小洞中的琼脂块。C 3 加入约。.0 1 m l加过热(在水浴中 煮沸1 5 m i n)的供凝固酶试验的肉汤培养物至所制备 载玻片 上的小洞中。C Q将载玻片置湿室中，于3 5 C 培养 4 h oC 5阳性反应为在小洞周围形成至少扩展约 1 mm的浅粉红色的晕圈。附录D
15、1 g 样品的最近似值(MP N)表 (补充件)以 0.1,0.0 1,0.0 0 1 g各用 3 管。阳性管数M P N一?性 管 数M PN0.1 0.0 1 0.0 010 0 00 0 10 0 20 0 30 1 00 1 10 1 20 1 30 2 00 2 10 2 20 2 30 3 00 3 10 3 20 3 3 1 1 0 0S N 01 72 一 9 2 附加说明:本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。本标准由中华人民共和国夭津进出口商品检验局、山东进出口商品检验局负责起草。本标准主要起草人何镜承、任怀秀。本 标准主 要参考 美国公职分析化学家协分(A O A C)法定 分析 方法第1 4 版第4 6.0 6 2,4 6.1 3 6-4 6.1 3 7 节(1 9 8 4年)。
