1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 动物源食品中大环内酯类抗生素残留检测方法第部分：微生物抑制法犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犿 犪 犮 狉 狅 犾 犻 犱 犲 狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊 犻 狀犪 狀 犻 犿 犪 犾 狅 狉 犻 犵 犻 狀犳 狅 狅 犱犘 犪 狉 狋：犕 犻 犮 狉 狅 犫 犻 犪 犾 犻 狀 犺 犻 犫 犻 狋 犻 狅 狀犿 犲 狋 犺 狅 犱 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售书书书前言本部分的附录 为规范性附录，附录为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并
2、归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本部分主要起草人：王敏、顾鸣、郭德华、杨捷琳、韩丽、邓晓军、杨惠琴、陈墨莲。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售动物源食品中大环内酯类抗生素残留检测方法第部分：微生物抑制法范围 的本部分规定了动物源食品中大环内酯类兽药残留检测的试样制备、保存和微生物抑制检测方法。本部分适用于肉类、水产品、动物内脏、鸡蛋和牛奶中大环内酯类兽药筛选检测，阳性结果应用其他方法进行确证。规范性引用文件下列文件中的条款通过 的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内
3、容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。分析实验室用水规格和试验方法（，：，）试样制备和保存 试样制备 牛奶：取不少于 试样，装入清洁容器内，进行标记。肉类、水产品、动物内脏：从原始样品中取出部分有代表性样品，将可食部分放入高速组织捣碎机均质，充分混匀，用四分法缩分不少于 试样。装入清洁容器内，进行标记。蛋：从原始样品中，随机分出一半（不少于 ），鲜蛋需去壳，进行标记。注：制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。试样保存 牛奶：保存。肉类、水产品、动物内脏和蛋：试样于 以
4、下保存。测定方法 方法提要试样经压榨得到样液，样液加到含有一定数量的嗜热脂肪芽孢杆菌培养基中，培养。利用抗生素对敏感菌的抑制作用来判别试样中是否含有抗生素。设备和材料 恒温箱：。离心机。高速组织捣碎机。均质器。恒温水浴锅：。涡旋振荡器。肉类榨汁器。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 克氏瓶。安瓿。可调移液器：，。菌种和培养基 菌种 嗜热脂肪芽孢杆菌犅 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊 狊 狋 犲 犪 狉 狅 狋 犺 犲 狉 犿 狅 狆 犺 犻 犾 狌 狊 犮 犪 犾 犻 犱 狅 犾 犪 犮 狋 犻 狊 。培养基 细菌保存及传代培养基：见附录第 章。增菌固体培养基：见附录 第 章。检定培养基
5、：见附录第 章。试剂本标准所用化 学试 剂 为 分析 纯，试 验 用 水 为 蒸 馏 水、去 离 子 水，试 验 用 水应 符 合 的规定。指示剂：溴甲酚紫，制法见附录 。甲醇。标准溶液：标准物质泰乐菌素：纯度。泰乐菌素标准储备液：。称取标准物质泰乐菌素 （精确至 ），用甲醇溶解并定容至 ，得到终浓度为 的泰乐菌素标准储备液，置冰箱中保存，可使用个月。泰乐菌素标准工作液：。吸取一定量的泰乐菌素标准储备液，用甲醇稀释成 的泰乐菌素标准工作液，置冰箱中保存，可使用周。测定步骤 样液制备 肉类、水产品、动物内脏：用肉类榨汁器榨汁，取大约 汁液作为待测样液。蛋：取禽蛋液体至清洁容器中，均质后直接取样。
6、牛奶：直接取样。菌悬液的制备一般情况下，菌种的传代次数不应超过代，否则在每次使用前确证其生化特性没有发生变异，或另需购置新的标准菌株。在确定保存的菌种生化特性没有改变后，将复活的菌种分别接种于盛有增菌固体培养基的克氏瓶中，培养 镜检芽孢数达 以上（如果达不到，可再培养数日，芽孢数量仍达不到要求，菌种可能变异，不可使用），用灭菌生理盐水洗下菌苔，使其悬浮于生理盐水中，水浴加热 ，犵离心 ，弃上清液，用灭菌生理盐水重复洗涤芽孢两次。然后用灭菌生理盐水制成菌悬液，用稀释平板计数的方法或比浊法进行菌体计数以确定菌悬液的浓度，菌悬液中菌体细胞的含量应达到 。置冰箱保存，贮存期个月。检定安瓿的制备将嗜热脂
7、肪芽孢杆菌菌悬液加入到融化后冷却至 左右的灭菌检定培养基中，充分混匀，使培养基中嗜热脂肪芽孢杆菌的浓度达到 。在灭菌安瓿中加入 混合液，保持水平待其凝固。取制备好的检定安瓿，加入 泰乐菌素标准工作液，室温放置 后，培养，琼脂培养基颜色不变色，仍呈现紫色的安瓿为合格，达不到要求的安瓿应弃去。制备好的安瓿置冰箱可保存周。测定取制备好的检定安瓿，其中一个加入 泰乐菌素标准工作液作为阳性对照，一犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售个加入 阴性样品样液作为阴性对照。吸取 待测样液加入检定安瓿中，将安瓿放置室温，预扩散；对于蛋、鱼、肾脏样品，预扩散后，需置于 水浴加热 。预扩散后，用蒸馏水洗涤安瓿
8、两次，洗去待测样液，去除安瓿内剩余的水，用铝箔纸封住安瓿口。将安瓿置于培养箱中，培养，直到阴性对照安瓿颜色变为黄色时停止培养。取出安瓿，根据安瓿内固体琼脂底部的三分之二部分的颜色判定结果。检测结果判断和报告如果待测样液安瓿内琼脂底部三分之二部分由紫色变为黄色，阳性对照安瓿内琼脂底部三分之二部分仍呈现紫色，即报告“阴性”。如果待测样液安瓿和阳性对照安瓿内琼脂底部三分之二部分仍呈现紫色，即报告“初筛阳性”。初筛阳性的样品可进一步用内酰胺酶排除内酰胺类药物，氨基苯酸排除磺胺类药物的可能（参见附录第 章）。阳性样品需要用确证方法进行定性和定量分析。检测限检测限见表。表检测限大环内酯类兽药检测限（）泰乐
9、菌素 红霉素 柱晶白霉素 交沙霉素 螺旋霉素 替米考星 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售附录犃（规范性附录）培养基犃 细菌保存培养基犃 成分胰蛋白胨 植物蛋白胨 氯化钠 琼脂 蒸馏水 犃 制法将各成分加热溶解，分装试管，高压灭菌 ，制成斜面。注：制成半固体时，琼脂量为。犃 增菌固体培养基犃 成分胰蛋白胨 植物蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钾 蒸馏水 琼脂 犃 制法将各成分加热溶解，分装 于克氏瓶内，高压灭菌 。犃 检定培养基犃 成分牛肉膏 大豆蛋白胨 蛋白胨 琼脂 蒸馏水 氯化钠 磷酸氢二钾 吐温 溴甲酚紫 葡萄糖 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售犃 制法 溴甲酚紫溶液配制：
10、称取 溴甲酚紫溶于 蒸馏水中。将各成分加热溶解，分装每瓶 ，每瓶中加入 溴甲酚紫溶液，高压灭菌 。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售附录犅（资料性附录）菌种的理化性状测定和 内酰胺类、磺胺类药物的排除犅 菌种的理化性状测定定期对菌种进行理化性状测试，以确定菌种没有受到污染或变异。对性状改变的菌种，需购置新的 菌种。测试的基本方法如下：将菌种 接种到传代培养基上，培养 后菌落为黄色，鉴定结果见表。表犅 菌种犃 犜 犆 犆 生化反应菌种项目结果革兰氏染色镜检酪素水解 淀粉水解精氨酸氨甲酰天冬氨酸脱水酶水解吲哚水解明胶水解卡巴肼水解树胶醛醣甘油水解 肝糖水解菊粉甘露醇水解水杨苷水解 犇海藻
11、糖水解卵磷脂注：“”表示阳性；“”表示阴性。犅 内酰胺类和磺胺类药物的排除对于初筛阳性的样品，加入 内酰胺酶溶液（活性单位）到 样液中，混匀后，吸取 到检定安瓿中培养。如果测定结果为阴性，则样品中可能含有 内酰胺类药物。对于初筛阳性的样品，加入 狆氨基苯酸溶液（）到 样液中，混匀后，吸取 到检定安瓿中培养。如果测定结果为阴性，则样品中可能含有磺胺类药物。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售犉 狅 狉 犲 狑 狅 狉 犱犃 狀 狀 犲 狓犃狅 犳 狋 犺 犻 狊狆 犪 狉 狋 犻 狊犪狀 狅 狉 犿 犪 狋 犻 狏 犲犪 狀 狀 犲 狓犃 狀 狀 犲 狓犅狅 犳 狋 犺 犻 狊狆 犪 狉
12、 狋 犻 狊犪 狀 犻 狀 犳 狅 狉 犿 犪 狋 犻 狏 犲犪 狀 狀 犲 狓犜 犺 犻 狊狆 犪 狉 狋狑 犪 狊狆 狉 狅 狆 狅 狊 犲 犱犫 狔犪 狀 犱 犻 狊狌 狀 犱 犲 狉 狋 犺 犲犮 犺 犪 狉 犵 犲 犱狅 犳 犮 犲 狉 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犪 犮 犮 狉 犲 犱 犻 狋 犪 狋 犻 狅 狀犪 犱 犿 犻 狀 犻 狊 狋 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳狋 犺 犲犘 犲 狅 狆 犾 犲狊犚 犲 狆 狌 犫 犾 犻 犮狅 犳犆 犺 犻 狀 犪 犜 犺 犻 狊狆 犪 狉 狋狑 犪 狊犱 狉 犪 犳 狋 犲 犱犫 狔犛 犺 犪 狀 犵 犺 犪 犻犈 狀
13、狋 狉 狔 犈 狓 犻 狋 犐 狀 狊 狆 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲犅 狌 狉 犲 犪 狌狅 犳 狋 犺 犲犘 犲 狅 狆 犾 犲狊犚 犲 狆 狌 犫 犾 犻 犮狅 犳犆 犺 犻 狀 犪 犕 犪 犻 狀犇 狉 犪 犳 狋 犲 狉狅 犳 狋 犺 犻 狊狆 犪 狉 狋犪 狉 犲 犠 犪 狀 犵犕 犻 狀，犌 狌犕 犻 狀 犵，犌 狌 狅犇 犲 犺 狌 犪，犢 犪 狀 犵犑 犻 犲 犾 犻 狀，犎 犪 狀犔 犻，犇 犲 狀 犵犡 犻 犪 狅 犼 狌 狀，犢 犪 狀 犵犎 狌 犻 狇 犻 狀，犆 犺 犲 狀犕 狅 犾 犻 犪 狀 犜 犺 犻 狊狆 犪 狉
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15、 犪 犾 犻 狀 犺 犻 犫 犻 狋 犻 狅 狀犿 犲 狋 犺 狅 犱犛 犮 狅 狆 犲犛 犖犜 狋 犺 犻 狊狆 犪 狉 狋 狊 狆 犲 犮 犻 犳 犻 犲 狊 狋 犺 犲犿 犲 狋 犺 狅 犱狅 犳 狊 犪 犿 狆 犾 犲狆 狉 犲 狆 犪 狉 犪 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犱 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犿 犪 犮 狉 狅 犾 犻 犱 犲 狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊犫 狔犿 犻 犮 狉 狅 犫 犻 犪 犾 犻 狀 犺 犻 犫 犻 狋 犻 狅 狀犿 犲 狋 犺 狅 犱 犻 狀犪 狀 犻 犿 犪 犾 狅 狉 犻 犵 犻 狀犳 狅 狅 犱犜 犺 犻 狊狆 犪 狉 狋
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