1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 大豆疫霉病菌实时荧光犘 犆 犚检测方法犇 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳犘 犺 狔 狋 狅 狆 犺 狋 犺 狅 狉 犪 狊 狅 犼 犪 犲狑 犻 狋 犺狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿 犲犘 犆 犚 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、南京农业大学、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局
2、、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中国农业大学。本标准主要起草人：章桂明、王源超、吴际云、彭金火、严进、程颖慧、王颖、易建平、崔澍、杨伟东、杨立群、聂文革、缪建锟。本标准为首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 大豆疫霉病菌实时荧光犘 犆 犚检测方法范围本标准规定了大豆疫霉病菌（犘 犺 狔 狋 狅 狆 犺 狋 犺 狅 狉 犪 狊 狅 犼 犪 犲 ）的实时荧光 检测鉴定方法。本标准适用于大豆夹杂的土壤传带大豆疫霉病菌的检测。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根
3、据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。分析实验室用水规格和试验方法 大豆疫霉病菌检疫鉴定方法原理 分类学地位学名：犘 犺 狔 狋 狅 狆 犺 狋 犺 狅 狉 犪 狊 狅 犼 犪 犲 病害名称：大豆疫霉病菌；常用英文名：犘 犺 狔 狋 狅 狆 犺 狋 犺 狅 狉 犪 分类 地 位：藻 菌 界 ，卵 菌 门 ，腐 霉 目 ，腐 霉 科 ，疫 霉属犘 犺 狔 狋 狅 狆 犺 狋 犺 狅 狉 犪 实时荧光犘 犆 犚利用荧光信号伴随着 产物的增加而增强的原理，在 扩增过程中，连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化，根据荧光信号基线的平均值
4、和平均标准差，得出大于平均值的荧光值即阈值，收集荧光信号增强到预定阈值时的 循环次数，即 值。根据 值判断样品是否带有大豆疫霉病菌。取样方法大豆夹杂土壤的取样按照 进行。仪器和试剂 主要仪器 烘箱。高压灭菌锅。摇床。水浴锅。纯水仪。高速冷冻离心机。实时荧光 仪。微量移液器（，）。真空抽干仪。犛 犖犜 主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合 中一级水的规格。提取液：（质量浓度），（），（），氯化钠。饱和酚。三氯甲烷。异戊醇。异丙醇。无水乙醇。反应试剂：、氯化镁、（、）、犜 犪 狇 。醋酸钠。检测与鉴定 土壤中卵孢子核酸制备 将试样研磨，过 目筛。置于样品瓶中，密封，并
5、标明标记。清洗实验器皿，于 、湿热灭菌或 干热灭菌。称取磨成粉末状的土样，倒入锥形瓶中，加 无菌水，再加 吐温，混匀，摇动 。将处理过的土样液倒入 目的筛网过筛，用清水不断冲洗；将下层冲洗液倒入 目的筛网抽气过筛，用清水不断冲洗；再次将下层冲洗液倒入 目的筛网抽气过筛，最后将筛网上卵孢子收集物倒入研钵，烘干。将烘干的卵孢子收集物加液氮进行充分研磨，然后加 预热的 抽提液，部分抽提液用于洗涤研钵。将离心管放入水浴锅前先振荡 ，然后放入 水浴锅水浴 ，每隔 振荡一次。加三氯甲烷，用移液器混匀 ，冰浴 ；，犵离心 ，取上清液加等体积异丙醇，轻轻摇匀，然后 静置 。，犵离心 ，小心去除上清液，留沉淀；
6、加 的酒精（预冷），洗涤三次，放入电热鼓风烘箱或微量浓缩器进行干燥，电热鼓风干燥箱温度设为 ，微量浓缩器温度设为 ；加入适量的去离子水，。实时荧光犘 犆 犚检测 犛 犢 犅 犚犌 犚 犈 犈 犖法 引物序列 引物序列：引物序列：扩增体系及条件扩增反应 的 各 成 分 为：，氯 化 镁，引物 和 各，犜 犪 狇酶 ，模板 ，补充去离子水至。将反应体系混匀后置于实时荧光 仪中进行反应。反应用双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有大豆疫霉病菌的 作为模板，阴性对照以不含有大豆疫霉病菌 作为模板，每个样品重复次。犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m 反应程序为：预热 ，然后进入循环反应：变
7、性，退火，延伸，共循环 次，循环后 延伸 。犕犌 犅探针法 引物及探针序列正向引物 ：反向引物 ：探针 ：扩增条件反应体系总体积为，各成分分别为：实时荧光反应混合液（含 ，氯化镁，犜 犪 狇酶），的对引物各 ，探针，去离子水，提取液。将反应体系混匀后置于实时荧光 仪中进行反应。反应用双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有大豆疫霉病菌的 作为模板，阴性对照以不含有大豆疫霉病菌 作为模板，每个样品重复次。设置扩增反应条件为：预热 ；变性 ；然后进入 个循环，。结果判定 实时荧光 所获结果中待测样品检测 值小于或等于，判定该样品检出大豆疫病病菌。实时荧光 所获结果中待测样品检测 值大于或等于，判定该样品
8、未检出大豆疫病病菌。实时荧光 所获结果中待测样品检测 值在 之间，应重做实时荧光 扩增。结果按照、判定：值仍然在 之间，且分离曲线明显的，判定该样品检出大豆疫病病菌。样品保存发现大豆疫霉病菌，该土壤样品应保存年，以备复验，如涉及到贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕。保存期满后，需经灭菌处理。犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准大豆疫霉病菌实时荧光犘 犆 犚检测方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街 号邮政编码：网址 电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元
