1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 贝类食品中食源性病毒检测方法纳米磁珠 基因芯片法犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 犳 狅 狅 犱犫 狅 狉 狀 犲狏 犻 狉 狌 狊 犲 狊 犻 狀狊 犺 犲 犾 犾 犳 犻 狊 犺犕犖 犘 犵 犲 狀 犲犮 犺 犻 狆犿 犲 狋 犺 狅 犱 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准的附录 为规范性附录，附录和附录为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、博奥生物有限公司暨生物芯片北京国家工程研究中心、北京金纳信生物有限
2、公司、天津生物芯片有限公司。本标准的主要起草人：曾静、周琦、魏海燕、陈广全、饶红、张西萌、藏庆伟、李燕鹏、张亮、汪琦、曹勃阳、聂棱、王敏。本标准系首次发布出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 贝类食品中食源性病毒检测方法纳米磁珠 基因芯片法范围本标准规定了贝类中甲肝病毒、型和 型诺如病毒、群轮状病毒和星状病毒的纳米磁珠 基因芯片检测方法。本标准适用于贝类中甲肝病毒、型和 型诺如病毒、群轮状病毒和星状病毒的检测；食物中毒样品中上述种病毒的检测可参照使用。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标
3、准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。分析实验室用水规格和试验方法 实验室生物安全通用要求 基因检验实验室技术要求术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本标准。术语和定义 基因芯片犵 犲 狀 犲 犮 犺 犻 狆生物芯片技术是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。甲肝病毒犺 犲 狆 犪 狋 犻 狋 犻 狊犃狏 犻 狉 狌 狊甲肝病毒属中只有人甲型肝炎病毒一个成员，
4、简称甲肝病毒。甲肝病毒粒子的直径约 ，个壳粒构成衣壳，呈球形，二十面体立体对称，无包膜；甲肝病毒的基因组为单股正链 ，端带有 尾。诺如病毒狀 狅 狉 狅 狏 犻 狉 狌 狊诺如病毒属于人类杯状病毒科，是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒直径约为 ，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称，诺如病毒基因组是单股正链 ，端具有 尾。诺如病毒共可分为个型，其中感染人的主要是 型和 型。轮状病毒 狉 狅 狋 犪 狏 犻 狉 狌 狊轮状病毒属于呼肠弧病毒科（）、轮状病毒属。病毒颗粒呈球形，直径 ，双犛 犖犜 层衣壳，无包膜，负染后在电镜下观察，病毒外形呈车轮状，故名轮状病毒。星状病毒犪 狊
5、狋 狉 狅 狏 犻 狉 狌 狊属于星状病毒科，星状病毒属。病毒颗粒呈球形，无包膜，直径为 。病毒基因组为单股正链 ，长 ，端有 尾。缩略语 犫 狆犫 犪 狊 犲狆 犪 犻 狉碱基对。犇 犈 犘 犆犱 犻 犲 狋 犺 狔 犾 狆 狔 狉 狅 犮 犪 狉 犫 狅 狀 犪 狋 犲焦碳酸乙二酯。犕犖 犘犿 犪 犵 狀 犲 狋 犻 犮狀 犪 狀 狅 狆 犪 狉 狋 犻 犮 犾 犲 狊纳米磁珠。犘 犈 犌狆 狅 犾 狔 犲 狋 犺 狔 犾 犲 狀 犲犵 犾 狔 犮 狅 犾聚乙二醇。犚 犖 犪 狊 犲 狉 犻 犫 狅 狀 狌 犮 犾 犲 犪 狊 犲核糖核酸酶或 酶。方法提要贝类样品经前处理后，用纳米磁珠和传
6、统方法提取病毒 ，将病毒 逆转录成 。以 为模板、用特异性引物进行 反应。扩增产物与固定有种病毒特异性探针的基因芯片进行杂交，用芯片扫描仪对杂交芯片进行扫描并判定结果。本方法利用了基因芯片高通量的特点，同时检测种食源性致病病毒。试剂所有实验用 试 剂 均 为 分 析 纯，所 有 试 剂 均 用 无 容 器 分 装；除 另 有 说 明，实 验 用 水 为 中一级水标准。阳性对照：病毒阳性样本，或选用含目的基因的质粒作为探针杂交的阳性对照。匀浆缓冲液：见附录 。匀浆缓冲液：见附录 。溶液：见附录 。水：见附录 。引物和探针：种病毒基因芯片检测所用引物核酸序列见表，探针核酸序列见表；根据表的核酸序列
7、合成引物，用 标记的引物加 水配制成 的浓度，未进行标记的引物加 水配制成 的浓度，保存，备用。表种病毒犚 犜 犘 犆 犚引物名称和序列病毒名称引物（）产物大小 甲肝病毒 犛 犖犜 表（续）病毒名称引物（）产物大小 星状病毒 诺如病毒型 诺如病毒型 群轮状病毒 注：诺如病毒型、诺如病毒型、星状病毒、甲肝病毒负链引物的 端用 标记；轮状病毒正链引物的 端用 标记。表种病毒特异性探针核苷酸序列病毒名称探针名称探针序列甲肝病毒 星状病毒 诺如病毒 型 诺如病毒 型 群轮状病毒 芯片杂交阳性对照 逆转录混合引物：用 水配制含种病毒负链引物的混合液，各引物浓度均为 。病毒核酸纳米磁珠提取试剂盒：包括纳米
8、磁珠、结合缓冲液以及核酸释放液（北京金纳信生物有限公司，），参见附录。裂解液：或其他等效产品。（）磁珠：?（）。）给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。逆转录试剂盒：（）。分子量标记：。酶。：各含 ，。缓冲液：见附录 。溴化乙锭溶液（）：见附录 。含 溴化乙锭的 琼脂糖凝胶：见附录 。磷酸盐缓冲液（）：见附录 。犛 犖犜 上样缓冲液：见附录 。洗液：，。洗液：。食源性病毒芯片检测试剂盒：博澳生物有限公司，），参见附录。三氯甲烷。异丙醇。）给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品。如果其他等效产品具有相同的效果
9、，则可使用等效产品。仪器与设备 组织匀浆器。仪。基因芯片扫描仪。凝胶成像系统。恒温水浴：，。恒温空气浴振荡器：，；，。涡旋混匀器。电泳仪。酸度计。高速冷冻离心机：，犵。低温冰箱：，。微量可调加样器及相应的无 吸头：，。无 管：、和 ，见附录 。基因芯片杂交围栏：晶芯基因微阵列芯片杂交盒，博澳生物有限公司）。锥形离心管：晶芯锥形离心管，博澳生物有限公司）。磁性抽提架。芯片杂交盒：博澳生物有限公司）。）给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。玻璃器皿：用于配制溶液的玻璃器皿应按附录 进行处理。无菌剪子和镊子。生物安全柜。天平：量程
10、，感量。磁力搅拌器。实验室要求实验室设施应达到 实验室技术要求。检测流程基因芯片检验流程见图。犛 犖犜 图基因芯片检验流程图制取样方法 样品的运输与保存储存和运输过程中保持样品温度在。实验室接到样品后应尽快进行检测。如暂时不能检测应将样品保存于 冰箱中，避免样品的反复冻融。取样首先用灭菌蒸馏水将贝壳表面的污泥清洗干净，打开贝壳后，倒掉腔内的液体，使用灭菌消毒的剪刀和镊子取贝类消化腺组织。制样在消化腺组织中加入 匀浆缓冲液，法提取轮状病毒 时，加入匀浆缓冲液；法提取星状病毒 时，加入匀浆缓冲液；采用 裂解法提取星状病毒、诺如病毒型、型和甲肝病毒 时，加入匀浆缓冲液。充分匀浆 ，温育 或室温下 ，
11、振荡 ；，犵，离心 。病毒 犚 犖 犃的提取 犕犖 犘法注：轮状病毒和星状病毒 的提取可以采用本方法。取 所得的上清液 转移到 离心管中，加入 溶液（终浓度为），颠倒次混匀。冰上放置至少，犵，离心 ，弃上清液，保留沉淀。向沉淀中加入 结合缓冲液，涡流混匀，尽量使沉淀充分溶解。加入 用结合缓冲液清洗平衡过的 （的平衡参见附录 ），充分混匀，室温下放置 ，每隔 ，颠倒混匀几次。将离心管放置于磁力架上，吸附纳米磁珠 ，弃上清液。加入 核酸释放液，用移液器使磁珠充分悬浮，加热 ，使病毒粒子裂解，释放病毒 ，立即置于冰上冷却 ，犵离心 ，将含有病毒 的上清液转移至新的无 的 离心管中，冰箱保存备用。该方
12、法提取的病毒 无需进一步纯化可以直接进行逆转录。犜 狉 犻 狕 狅 犾 狉 犲 犪 犵 犲 狀 狋裂解法注：星状病毒、甲肝病毒、型诺如病毒和 型诺如病毒 的提取可采用本方法。将 中的上清液全部转移到无 的 离心管中（可以分装于个 离心管），加入等体积 的 溶液（终浓度为），上下颠倒离心管以充分混匀。将离心管置于犛 犖犜 冰上至少，犵离心 。弃去上清液。加入 ，用枪头吹打或剧烈涡旋振荡的方式使沉淀充分溶解，直至看不见固体沉淀物，室温放置 。将溶解的沉淀转移至 或 无 的离心管中，加入 三氯甲烷，剧烈涡旋混匀 ，室温放置 。，犵离心 ，小心吸取上清液至一无 的 离心管中。加入 倍体积的异丙醇，上下
13、颠倒充分混匀后室温放置 。，犵离心 ，弃上清液，用预冷的 乙醇洗涤沉淀。加入 水，加热 ，使沉淀完全溶解。得到的 溶液需进一步纯化后才可用于逆转录。病毒 犚 犖 犃的纯化注：按照?（）使用说明进行 纯化。将 所得的 溶液置于 温育 ，立即置于冰上。温育 溶液同时，转移 已充分重悬的 （）至 无 的离心管中，磁力架上放置，小心吸弃上清液。将离心管从磁力架上取出，加入 吸附缓冲液充分重悬磁珠，磁力架上放置，小心吸弃上清液。将离心管从磁力架上取出，加入 吸附缓冲液充分重悬磁珠。将 所得 溶液全部转移至 的离心管中，轻柔混合，使磁珠与 溶液充分混匀，室温放置 。将离心管置于磁力架上 ，小心吸弃上清液。
14、将离心管从磁力架上取出，加入 漂洗缓冲液重悬磁珠，磁力架上放置 ，小心吸弃上清液（尽量吸尽液体）。加入 充分重悬磁珠，加热 后立即置于磁力架上，待上清澄清后立即将上清液（洗脱下来的 ）转移至一干净的无 的 离心管中。制备好的 应尽快进行逆转录。若暂时不能进行逆转录，应于 保存备用。逆转录犘 犆 犚（犚 犜 犘 犆 犚）逆转录反应体系和反应条件将贝类样品中提取的种病毒 混合均匀后同时进行针对种病毒的逆转录。逆转录反应体系和反应条件见表。每个反应体系设置两个平行。反应体系中各试剂的量可根据具体情况进行适当的调整。以目的病毒 作为阳性对照，以不含目的病毒的贝类 作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照
15、。表逆转录反应体系和反应条件反应液组成加样量逆转录混合引物（）随机引物 （）样品总 混匀，加热 ，冰浴 缓冲液（）（）犛 犖犜 表（续）反应液组成加样量 （）（）反转录酶混匀，保温 多重犘 犆 犚反应体系 甲肝病毒与星状病毒多重 反应体系见表。表甲肝病毒与星状病毒多重犘 犆 犚反应体系成分加样量 缓冲液（）（）（）（未标记 ）和 （未标记 ）各 （荧光标记 ）和 （荧光标记 ）各 （）水 诺如病毒 型、型和轮状病毒多重 反应体系见表。表诺如病毒 犌型、犌型和轮状病毒多重犘 犆 犚反应体系成分加样量 缓冲液（）（）（）（未标记 ），（未标记 ）和 （荧光标记 ），其余各 （荧光标记 ），（荧光标
16、记 ）和 （未标记 ），其余各 （）水 反应参数如下：；，个循环；。注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。产物的琼脂糖凝胶电泳检测（根据需要进行）可以将 中所得 产物直接用于芯片杂交；也可以将 产物进行电泳，检查扩增结果后进行芯片杂交。将适量 稀释成 溶液，配制溴化乙锭含量为 的 琼脂糖凝胶。取 产物，加 上样缓冲液点样，在琼脂糖凝胶的两边或中间位置点样 分子量标记，用来判断 产物片断的大小。电泳电压根据电泳槽的长度来确定，一般控制在犛 犖犜 ，当电泳指示剂溴酚蓝移动到凝胶边缘时关闭电源，电泳结果检测采用凝胶成像系统。注：芯片杂交反应比 反应灵敏度高 倍左右，检测结果没有明显扩增条带，进行芯片杂交时，也可能有较强的杂交信号。芯片杂交 芯片杂交体系将 和 所得 产物进行等体积混合。按表配制杂交液，充分混匀，犵离心。表病毒芯片杂交体系成分加样量终浓度 甲酰胺 基因 产物 产物 总体积 注：每个点阵。一张芯片共个点阵，可以杂交四份样本。芯片杂交 犘 犆 犚产物变性将配制好的 的杂交体系在，变性 ，立即置于冰上，冰浴 。杂交打开芯片杂交盒，将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒底部凹槽内加入
