1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准?番茄环斑病毒检疫鉴定方法?发布?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈红运、邓丛良、陈青、赵文军、黄文胜、廖富荣、林石明、朱水芳。犛 犖犜 番茄环斑病毒检疫鉴定方法范围本标准规定了番茄环斑病毒检疫鉴定方法。本标准适用于可能携带番茄环斑病毒的进境种子、苗木、组培苗等繁殖材料的检疫与鉴定。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不
2、可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。植物病毒免疫电镜检测方法 进出境植物及植物产品检疫抽样原理 学名与分类地位学名：缩写：分类地位：豇豆花叶病毒科（）；线虫传多面体病毒属（犖 犲 狆 狅 狏 犻 狉 狌 狊）。其他资料参见附录。粒体形态番茄环斑病毒粒体为等轴对称二十面体，直径 。基因组基因组由两条单链正义 组成，为 ，为 。多个分离物的基因组已被测序，各分离物之间序列同源性较低，根据依赖于 的 聚合酶编码区序列设计 引物可检测烟草株系（）、桃黄芽花叶株系（）、葡萄黄脉株系（）及多个 分离物。仪器设备、用具
3、及试剂 仪器设备酶联检测仪、天平（感量，）、仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离温室、组织捣碎机、恒温水浴、低温冰箱等。用具微量移液器（、）、酶联板、研钵等。犛 犖犜 试剂酶联免疫吸附测定试剂（见附录）、反转录聚合酶链式反应（）检测试剂（见附录）。样品制备 种子抽样按照 的规定执行。将种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，于 生长并进行症状观察。待长出片片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（株为组）并编号。苗木按 规定抽样。将苗木种植于隔离温室中，于 生长并进行症状观察。有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法同。检测方法 酶联免疫吸附测定见附录。犚 犜 犘
4、犆 犚检测见附录。免疫电镜检测按照 的规定执行。生物学测定参见附录。结果判定、和 中的两种方法检测结果为阳性，即可判定检出番茄环斑病毒。酶联测定为阳性后，或免疫电镜检测结果为阳性可判定检出番茄环斑病毒。必要时可进行生物学测定，并进行复验。样品保存 样品保存经检验确定携带番茄环斑病毒的样品应在合适的条件下保存，种子保存在，病株在 或者 冰箱中保存，做好标记和登记工作。犛 犖犜 结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。酶联测定需有酶联极反应的原始数据，检测需有电泳结果图片，生物学测定需有鉴别寄主的症状照片，电镜观察
5、需有病毒粒体照片。犛 犖犜 附录犃（资料性附录）番茄环斑病毒相关资料犃 寄主范围 的自然寄主有天竺葵属（犘 犲 犾 犪 狉 犵 狅 狀 犻 狌 犿 ）、悬钩子属（犚 狌 犫 狌 狊 ）、李属（犘 狉 狌 狀 狌 狊 ）和烟草（犖 犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪 狋 犪 犫 犪 犮 狌 犿）等。在人工接种的情况下还可以侵染茄科、藜科、葫芦科、蔷薇科和豆科的 多种植物。犃 病害症状 主要侵染多年生植物，在桃和其他李属植物上表现黄芽花叶症状；桃、樱桃和一些李属植物上表现茎部蚀损斑和退化症状；李树被 侵染后产生褐色线条；侵染苹果树后嫁接部位上方膨大，接穗和砧木连接处的树皮异常增厚并呈海绵状，剖开树皮后
6、可发现明显的坏死线，苹果树也可出现衰退症状；在红树莓（）上表现环斑和衰退症状；葡萄等多种植物被 侵染后均可出现衰退症状。犃 分布地区 主要分布于美洲、欧洲、大洋洲、亚洲的一些国家：美国、加拿大、秘鲁、智利、保加利亚、德国、意大利、法国、前苏联地区、前南斯拉夫、塞浦路斯、澳大利亚和韩国、日本等。犃 传播方式犃 近距离传播 在田间主要通过土壤中的剑线虫传播，剑线虫属中可能的传播介体有：犡 犻 狆 犺 犻 狀 犲 犿 犪犪 犿 犲 狉 犻 犮 犪 狀 狌 犿，犡犮 犪 犾 犻 犳 狅 狉 狀 犻 犮 狌 犿，犡犻 狀 犮 狅 犵 狀 犻 狋 狌 犿，犡狅 犮 犮 犻 犱 犻 狌 犿，犡狉 犻 狏 犲
7、 狊 犻，犡狋 犺 狅 狉 狀 犲 犻，犡狌 狋 犪 犺 犲 狀 狊 犲。机械接种、种子、花粉也能传播该病毒。犃 远距离传播 通过带毒种子、苗木、组培苗等繁殖材料的运输发生远距离传播。犛 犖犜 附录犅（规范性附录）双抗体夹心酶联免疫吸附测定犅 试材犅 酶联板的要求使用质量有保证厂商生产的酶联板。犅 包被抗体特异性的番茄环斑病毒抗体。犅 酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的番茄环斑病毒抗体。犅 底物对硝基苯磷酸二钠（）。犅 样品抽提缓冲液（狆 犎 ）亚硫酸钠（）（）叠氮钠（）储存。犅 包被缓冲液（狆 犎 ）碳酸钠（）碳酸氢钠（）叠氮钠（）蒸馏水定容至，储存。犅 犘 犅 犛 犜缓冲液（洗涤缓冲液狆 犎 ）氯
8、化钠（）磷酸氢二钠（）磷酸二氢钾（）氯化钾（）吐温 蒸馏水定容至。犛 犖犜 犅 酶标抗体稀释缓冲液（狆 犎 ）（牛血清白蛋白）或脱脂奶粉 （）叠氮钠（）储存。犅 底物（狆 犖 犘 犘）缓冲液（狆 犎 ）氯化镁（）叠氮钠（）二乙醇胺 溶于 蒸馏水中，用盐酸调 值至，蒸馏水定容至，储存。犅 程序犅 包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，孔，加盖，孵育，清空孔中溶液，洗涤次，每次 。犅 样品制备待测样品按（质量体积）加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，离心 ，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。犅 加样加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照，孔
9、，每一样品设一重复。加盖后于 冰箱孵育过夜，酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸馏水洗涤次，洗涤次，每次 。犅 加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到酶联板中，孔，加盖，孵育，酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸馏水洗涤次，洗涤次，每次 。犅 加底物将底物 加入到底物缓冲液中使终浓度为 （现配现用），按 孔，加入到酶联板中，室温避光孵育。犅 读数在不同的时间内如 、，或更长时间，用酶联仪在 处读 值，或用肉服观察显色情况。犅 结果判断犅 对照孔的 值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：犛 犖犜 缓冲液孔和阴性对照孔的 值 ，当阴性对照孔的 值 时，
10、按 计算；阳性对照 值阴性对照 值；同一样品的重复性基本一致。犅 在满足了 质量要求后，结果原则上可判断如下：样品 值阴性对照 值，判为阳性；样品 值阴性对照 值接近阈值，判为可疑样品，需重新做一次，或者任选、和 中的一种方法加以验证；样品 值阴性对照 值明显，判为阴性。犅 若满足不了 质量要求，则不能进行结果判断。犛 犖犜 附录犆（规范性附录）犚 犜 犘 犆 犚检测犆 试剂犆 裂解液。犆 ：冰乙酸 加去离子水定容至。用时加水稀释至 。犆 加样缓冲液：溴酚蓝（质量浓度）蔗糖水溶液犆 实验步骤犆 总犚 犖 犃提取称取 植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移入灭菌的 离心管中，加入 的 试剂，剧烈
11、振荡摇匀 ；，犵离心 ，取上清液；加入饱和苯酚三氯甲烷异戊醇（），上下颠倒混匀；，犵离心 ，取上清液；重复饱和苯酚三氯甲烷异戊醇抽提步骤次；加 倍体积的异丙醇，颠倒混匀；，犵离心 ，弃上清液；加 的乙醇洗涤沉淀，犵离心 ，弃乙醇；沉淀于室温下充分干燥后，溶于 （处理）中，保存备用。也可采用其他有效的 提取方法。犆 犚 犜 犘 犆 犚反应 检测引物见表。的合成：在 反应管中，加入总，下游引物（），水浴 ，取出后立即放在冰上，加入 ，水浴 ，然后再加入 ，混匀后 水浴 ，水浴 ，合成 。和 的用量需要依据反转录酶的品牌进行调整。表犆 犚 犜 犘 犆 犚检测的引物检测基因引物序列复制酶上游引物 ：下
12、游引物 ：犛 犖犜 反应体系见表。反应参数：；，个循环；。表犆 犘 犆 犚反应体系试剂名称加样量 缓冲液 氯化镁（）（）上游引物（）下游引物（）犜 犪 狇酶（）模板 补足反应总体积为 犆 琼脂糖电泳犆 制备凝胶将 和电泳级琼脂糖按（质量浓度）配好，在微波炉中熔化混匀，冷却至 左右。犆 加溴化乙锭加入溴化乙锭浓度为 ，混匀，倒入已封好的凝胶平台上，插上样品梳。待凝胶凝固后，从制胶平台上除去封带，拔出梳子，加入足够量的 （缓冲液没过凝胶表面约）。犆 电泳用加样缓冲液与样品混合，然后将其和适合的 分子量标准物分别加入到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统观察并保留结果。犆 结果判断犆 阳
13、性对照在 处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。犆 结果达到质控要求，且样品在 处无扩增条带，判定结果为阴性。犛 犖犜 附录犇（资料性附录）生物学测定犇 接种病叶加（质量体积）的磷酸盐缓冲液（，）于研钵中充分研碎，在待接种植物叶片表面均匀洒上硅藻土，用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面。犇 寄主症状苋色藜（犆 犺 犲 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狌 犿犪 犿 犪 狉 犪 狀 狋 犻 犮 狅 犾 狅 狉）和昆诺藜（犆狇 狌 犻 狀 狅 犪）：小的褪绿或坏死局部斑；顶端系统性坏死。黄瓜（犆 狌 犮 狌 犿 犻 狊 狊 犪 狋 犻 狏 狌 狊）：局部褪绿斑；系统褪绿和斑驳。番茄（犔 狔 犮 狅 狆 犲 狉 狊 犻 犮 狅 狀 犲 狊 犮 狌 犾 犲 狀 狋 狌 犿）：局部坏死斑；系统斑驳和坏死。普通烟（犖 犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪 狋 犪 犫 犪 犮 狌 犿）：局部坏死斑或环；系统性坏死或褪绿环。矮牵牛（犘 犲 狋 狌 狀 犻 犪犺 狔 犫 狉 犻 犱 犪）：局部坏死斑。菜豆（犘 犺 犪 狊 犲 狅 犾 狌 狊 狏 狌 犾 犵 犪 狉 犻 狊）：局部褪绿斑；顶部叶片系统皱缩和坏死。豇豆（犞 犻 犵 狀 犪狌 狀 犵 狌 犻 犮 狌 犾 犪 狋 犪）：褪绿或局部坏死斑；多数分离物引起顶部系统坏死。犛 犖犜
