1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 进出口辐照食品检测方法微生物学筛选法犇 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳 犻 狉 狉 犪 犱 犻 犪 狋 犲 犱犳 狅 狅 犱犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犕 犻 犮 狉 狅 犫 犻 狅 犾 狅 犵 犻 犮 犪 犾 狊 犮 狉 犲 犲 狀 犻 狀 犵犿 犲 狋 犺 狅 犱 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准的附录 为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郭利平、胡群、邹春颖。本
2、标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 进出口辐照食品检测方法微生物学筛选法范围本标准规定了进出口食品是否经过辐照处理的微生物学快速筛选方法。本标准适用于冷冻禽肉、畜肉、水产品等各类生鲜食品是否经过辐照处理的快速筛选。本标准适用于从上述食品中筛选出可能经过辐照处理的食品，但不排除其他不破坏食品中内毒素的灭菌方法对该食品进行过处理。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是未注明日期的引用文件，其最新版本
3、适用于本标准。分析实验室用水规格和试验方法 出口食品中微生物学检验通则方法提要内毒素是存在于革兰氏阴性菌细胞外膜上的特有成分，食品经过一定剂量辐照处理后，食品中活的革兰氏阴性菌基本上会被杀死，但是所残留的内毒素，不会因为辐照处理而消失。因此可以通过对内毒素的定量测定来估计食品中被杀死和未被杀死的革兰氏阴性菌总数，结合食品中活的革兰氏阴性菌的培养计数，比较两者差异可以判断该食品是否经过辐照处理。术语和定义下列术语和定义适用于本标准。革兰氏阴性菌犵 狉 犪 犿狀 犲 犵 犪 狋 犻 狏 犲犫 犪 犮 狋 犲 狉 犻 犪，犌 犖 犅用革兰氏染色法染色后呈红色或土黄色的细菌，如大肠杆菌、志贺氏菌、沙门
4、氏菌、痢疾杆菌和伤寒杆菌等。内毒素 犲 狀 犱 狅 狋 狅 狓 犻 狀内毒素又名脂多糖、类脂、热源，是革兰氏阴性菌的细胞外膜上特有成分，可以迅速地引起鲎血细胞裂解形成凝固。内毒素检测 犾 犻 犿 狌 犾 狌 狊犪 犿 狅 犲 犫 狅 犮 狔 狋 犲 犾 狔 狊 犪 狋 犲 狋 犲 狊 狋，犔 犃 犔内毒素可激活鲎试剂的凝固酶原，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶，利用该现象可以对样品中存在的内毒素进行检测。设备和材料 可调温水浴锅。犛 犖犜 高压灭菌锅。电热恒温培养箱。高温烘箱。涡旋振荡器。电子天平：感量为 。均质器：。灭菌吸管：，具有 刻度。微量移液器：，。一次性注射用针筒：。试管：。灭菌培养皿：
5、直径。酒精灯。灭菌剪刀。纯水制备器。石蜡封口膜。微量离心管：。无热源安瓿瓶。培养基与试剂 实验用水符合 二级水规格（电导率 ）。缓冲蛋白胨水（见附录第 章）。营养琼脂培养基（见附录第 章）。牛奶琼脂培养基（见附录 ）。结晶紫溶液（见附录 ）。青霉素溶液（见附录 ）。革兰氏阴性菌选择性培养基（见附录 ）。注射用无热源生理盐水。去离子水。内毒素标准品：管。鲎试剂）：灵敏度 。）厦门鲎试剂厂生产的鲎试剂为适合市售产品的实例，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他产品具有相同的效果，可经实验评估后使用这些等效产品。样品抽样、贮存和运送 抽样数量及抽样方法按 进行。样品的
6、贮存和运送样品应于保存，内送往实验室检验，如不能立即检验，应置于 保存，最长保存时间不超过。检验程序辐照食品微生物学筛选法检验程序见图。犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m图辐照食品微生物学筛选法检验程序检验步骤 制样无菌条件下于样品的不同部位取样，共取 样品于已灭菌的塑料容器中，用一次性针筒加 注射用无热源生理盐水，以 均质 ，制成 样品稀释液，于下保存备用，最长保存时间不超过。革兰氏阴性菌培养计数 培养基制备制备缓冲蛋白胨水、营养琼脂培养基、革兰氏阴性菌选择性培养基（参见附录），倾注平板前将融化的培养基于 水浴保温。犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m 接种
7、和培养 根据样品污染情况，对样品稀释液（）作进一步的稀释，用缓冲收蛋白胨水对样品稀释液按照 比 的体积比进行 倍梯度稀释，得到 样品稀释液。把保持在 的营养琼脂培养基约 倾入培养皿中，水平放置，待琼脂冷却凝固，加入 的不同稀释度的稀释液涂布后于 下静置 。每个稀释度做两个平板。每个平板覆盖 革兰氏阴性菌选择性培养基，使样液与培养基充分混合。水平放置，使琼脂凝固。倒置平板于 培养箱中培养。选择菌落数为 的个连续稀释度平板计数（见表中例）。按式（）计算每克样品中的革兰氏阴性菌数犖（）：犖犮犞狀（狀）犱（）式中：犖 每克样品中革兰氏阴性菌数，；犮 长有 菌落的个连续稀释度平板的菌落之和；犞 每个平板
8、接种的菌液体积，单位为毫升（）；狀 第一个稀释度的计数平板数；狀 第二个稀释度的计数平板数；犱 计数有效平板的第一个稀释度。若只有一个稀释度的平板长有 个菌落时，则狀计为（见表中例）。若所有稀释度的平板菌落数均小于 时，则以菌落数最多的平板的菌落数作为犖值的估计值（见表中例）。若所有稀释度的平板菌落均未长菌时，结果表示为未检测到革兰氏阴性菌，犖值计为（见表中例）。表革兰氏阴性菌菌落数计算示例例次稀释液及菌落数 计 算 方 式 犖 （）犖 犖犖 内毒素检测 原理在适宜条件下，细菌内毒素可激活鲎试剂中的凝固酶原，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。内毒素与革兰氏阴性菌含量呈线性关系，所以可以根据内毒素的
9、含量测定革兰氏阴性菌的污染程度。样品稀释取 样品稀释液，加入装有 无热源生理盐水的 已高温高压灭菌的微量离心管中，稀释倍数为 ，按照相同的体积比，将样品稀释液作进一步梯度稀释，稀释倍数视样品情况而定，要求最后一个稀释倍数的样品内毒素检测为阴性。内毒素标准品溶解与稀释取一管内毒素标准品，加入 无热源生理盐水溶解为 的内毒素标准品溶液，同犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m 样品稀释法进行不同倍数稀释。鲎试剂溶解与分装按试剂标示量，加入无热源生理盐水溶解，混匀，注意不要引起气泡，以每支 分装于安瓿瓶内。鲎试剂检测以内毒素标准品溶液作为阳性对照，无热源生理盐水作为阴性对照，取 稀释样
10、品与分装的 鲎试剂混匀，用石蜡封口膜封口，于 的水浴锅中静止放置 ，当试剂发生完全凝集时记为“”，部分凝集时记为“”，未凝集时记为“”。内毒素定量根据不同稀释倍数内毒素标准品溶液的检测情况确定检测鲎试剂的灵敏度。以发生凝固的最后一个样品稀释溶液的滴度用于计算，如果完全凝固时，以实际滴度用于计算（见表中例），如果为部分凝固“”时，则以该倍数的指数减去 后作为滴度值用于计算（见表中例）。按式（）计算每克样品中内毒素含量犔 犃 犔（）：犔 犃 犔犮 狋 犜（）式中：犔 犃 犔 每克样品中内毒素含量，；犮 标准品中内毒素含量，；狋 样品的滴度值；犜 标准品的稀释倍数。表内毒素滴度计算示例例次稀释度及内
11、毒素反应情况 滴度 结果报告 计算 犔 犃 犔、犖和 犔 犃 犔 犖值。当样品经检测含有较高的内毒素含量，但经培养的革兰氏阴性菌数目较少或者未检测出有可培养的革兰氏阴性菌，即经计算 犔 犃 犔 犖值大于，报告为该样品可能经过辐照处理。若样品经检测含有较高的内毒素含量，经培养的革兰氏阴性菌数目较多，经计算 犔 犃 犔 犖值小于或等于，报告为该样品未经过辐照处理。当样品中内毒素含量较低（犔 犃 犔）并且经培养的革兰氏阴性菌数目较少（犖），报告为本方法不适用。犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m附录犃（规范性附录）培养基犃 缓冲蛋白胨水犃 成分氯化钠 酪蛋白酶 去离子水 犃 制法将上
12、述各成分混匀，不断加热搅拌溶解，调 为 ，分装试管，高压灭菌 ，保存备用，可储藏。犃 营养琼脂培养基犃 成分氯化钠 酪蛋白酶 牛肉膏 酵母提取物 琼脂 （根据琼脂的凝胶性能决定）去离子水 犃 制法将上述各成分加热煮沸溶解后，调 为 ，高压灭菌 ，冷却至 备用。犃 革兰氏阴性菌选择性培养基犃 牛奶琼脂培养基犃 成分酵母提取物 蛋白胨 奶粉 琼脂 乳酸链球菌肽（单位）去离子水 犃 制法将上述各成分加热煮沸溶解后，调 为 ，高压灭菌 ，冷却至 备用。犃 结晶紫溶液犃 成分结晶紫 去离子水 犛 犖犜 犃 制法溶液用 滤膜过滤后备用，可储藏。犃 青霉素溶液犃 成分青霉素 （万单位）去离子水 犃 制法溶液用 滤膜过滤后备用，可储藏。犃 革兰氏阴性菌选择性培养基犃 成分青霉素溶液 结晶紫溶液 牛奶琼脂培养基 犃 制法高压灭菌后的牛奶琼脂培养基，熔化后冷却至 后加入青霉素溶液和结晶紫溶液，充分混匀后倾注平板。犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口辐照食品检测方法微生物学筛选法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街 号邮政编码：网址 电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元
