1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准?猪圆环病毒病检疫技术规范?发布?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、广东省农业科学院兽医研究所。本标准主要起草人：朱道中、刘中勇、刘俊平、宋长绪、蒋智勇、陶琦、陈茹、林志雄。犛 犖犜 猪圆环病毒病检疫技术规范范围本标准规定了猪圆环病毒病的病毒分离、鉴定和疫病诊断等方法的技术要求。本标准适用于猪圆环病毒病的监测、检疫、诊断和流行病学调查。规范性引用文件下列文件对于本文件的
2、应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法缩略语下列缩略语适用于本文件。值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阀值时所经历的循环数 ：细胞病变效应：脱氧核糖核酸 ：异硫氰酸荧光黄 ：间接免疫荧光试验：最低要求培养基 ：分子量标记物 ：巢式聚合酶链式反应 ：猪圆环病毒型 ：猪圆环病毒型 ：猪肾传代细胞系 ：磷酸盐缓冲液 ：荧光聚合酶链式反应 ：十二烷基磺酸钠犜 犪 狇酶：犜 犪 狇 聚合酶检疫方法 病毒的分离与鉴定 器材 孔或 孔细胞培养板、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳恒温
3、箱、普通冰箱及低温冰箱、离心机及离心管、组织研磨器、的微孔滤膜、普通光学显微镜。犛 犖犜 试剂培养液、胎牛血清、氨基葡萄糖、青霉素（）和链霉素（）溶液。犘 犆 犞 易感细胞 细胞。犘 犅 犛见附录。病料采集无菌采集病死猪的腹股沟淋巴结、脾、肺、肾等组织样品或病猪的抗凝血，保存，立即送检。若不能立即送检，应置 以下条件保存备检。病毒分离将采集的组织样品用 按 的比例进行稀释，研磨成匀浆，或取病猪的抗凝血，反复冻融次后，犵离心 ，取上清液，经微孔滤膜过滤除菌，接种在无 感染的正常 细胞单层上，感作，倾尽接种液，加入含 胎牛血清的 培养液（含 的青霉素和 的链霉素），继续培养，弃上清液，加入 的 氨
4、基葡萄糖 ，作用 ，倾去，洗涤，再加入含胎牛血清的培养液（含 的青霉素和 的链霉素），继续培养 。病毒鉴定 感染 细胞后不产生明显的细胞病变效应，故需采用 （见）或 （见）等方法做进一步的鉴定。间接免疫荧光试验（犐 犉 犃）器材 诊断板、荧光显微镜、恒温箱、保湿盒、微量移液器等。试剂 单克隆抗体、结合物、胰蛋白酶、丙酮。操作方法 吸取 接种过待检样品、经 胰蛋白酶消化的 细胞，加入 诊断板中，置超净工作台中风干，然后加 丙酮（预冷）固定 ，同时设正常 细胞孔和感染了 的 细胞孔作为阴、阳性对照。用 （孔）清洗 诊断板次，每次 ，最后弃去 ，在吸水纸上轻轻拍干。滴加工作浓度（稀释 倍）的鼠源 单
5、克隆抗体 ，置于湿盒内，感作。清洗 诊断板次，方法同 。加入工作浓度（稀释 倍）的兔抗鼠 结合物，孔，置于湿盒内，感作 。犛 犖犜 弃去板中液体，清洗次，方法同 。荧光显微镜检查在放大 条件下镜检，荧光显微镜采用蓝紫光（波长：）。结果判定与解释标准阳性细胞孔：细胞边界清晰，胞浆内应出现典型的特异性亮绿色荧光。标准阴性细胞孔：细胞边界清晰，细胞胞浆内不应出现特异性亮绿色荧光。在阴阳性对照孔检测结果成立的条件下，待检样品细胞孔的细胞胞浆内如出现特异性亮绿色荧光，则证明待检样品内含有 ，判为阳性；否则，判为阴性。巢式聚合酶链式反应（狀 犘 犆 犚）器材微量振荡器、仪、微量加样器（；）及配套的带滤芯吸
6、头、生物安全柜、高速台式冷冻离心机（离心速度 犵以上）、凝胶成像系统、电泳仪、管、的离心管等。试剂 缓冲液（）（见附录）。染料：的溴化乙锭（）或 替代物（）。上样缓冲液（）。苯酚、三氯甲烷、无水乙醇、异戊醇、乙酸钠，均为分析纯，保存备用。酶与缓冲液：犜 犪 狇酶（）、缓冲液。氯化镁（）。：含 、各 ，保存，避免反复冻融。琼脂糖。蛋白酶。十二烷基磺酸钠（）。扩增引物：外部引物对（、）可以扩增 的核苷酸序列，也可以扩增 的核苷酸序列，扩增产物约为 ；内部引物对（、）只可以扩增 的核苷酸序列，扩增产物约为 。样品制备 脏器组织采集病死猪的腹股沟淋巴结、脾、肺、肾等组织样品，用 按 的比例稀释，研磨成
7、匀浆，反复冻融次后，犵离心 ，取上清液置于 的离心管内编号备检。犛 犖犜 细胞悬液将接种过疑似含 样品的细胞培养液反复冻融次后，犵离心 ，取上清液置于 的离心管内编号备检。抗凝血将采集的病猪抗凝血直接编号后备检或保存备检。对照取 细胞增殖液或 自然感染恢复后的猪抗凝血作为阳性对照；取无 感染的细胞悬液或无 感染且未经免疫的猪抗凝血作为阴性对照；取无菌去离子水作为空白对照。操作步骤 犇 犖 犃模板的制备取病猪抗凝血或经匀浆后提取的组织上清液或细胞悬液 ，加入 的 ，然后加入蛋白酶至终浓度 和 至终浓度，水浴，用等体积的苯酚、苯酚三氯甲烷异戊醇混合液（体积比为 ）、三氯甲烷各抽提次，吸取水相，加入
8、 体积 的乙酸钠和 倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，沉淀，条件下（犵）离心 ，弃上清液，沉淀干燥后悬浮于无菌去离子水中，取适量用作 模板或 以下保存备用。反应体系（两次的反应体系均为 犔）引物（浓度为 ）：上下游引物各。缓冲液：。的 ：。犜 犪 狇酶：。模板：。加入 的无菌去离子水，充分混匀，犵以下瞬时离心，置 仪内开始反应。对照组的设置同时设置 阴性对照、阳性对照和空白对照。对照组反应体系中，除模板外其余组成成分与 相同。反应条件（两次的反应条件相同）预变性：。扩增：，个循环。延伸：。反应结束后取出 反应管，犵以下瞬时离心，取扩增产物进行电泳分析。电泳分析取 琼脂糖，加入 的 缓冲液（见附录），
9、配制 的琼脂糖溶液。加热溶解，待冷却（约）后，在每 琼脂糖溶液中加入的 溶液（）或 替代物（），混匀，制备电泳凝胶。在凝胶孔内分别添加扩增产物（需和上样缓冲液充分混合）和犛 犖犜 分子量标记物（），电泳（电压约为）后取琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统内进行分析。序列测定对扩增产物（最好预先进行适当的浓缩）进行序列测定，然后运用适当的软件对测序结果进行同源性分析。结果判定在各对照组成立的条件下，以标准 及阳性对照为基准，结束后若得到 左右的电泳条带，则可初步判断为 阳性，否则判为 阴性。若 扩增产物与 中发布的有关序列或参考序列（参见附录）的同源性高于 以上，则判为 阳性，否则判为 阴性。荧光聚合酶链
10、式反应（狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿 犲犘 犆 犚）试剂 犜 犪 狇酶（），保存。：含 、各 ，保存。苯酚、三氯甲烷、无水乙醇、乙酸钠，均为分析纯，保存备用。乙醇，保存备用。荧光定量 试剂盒（或 ），购于试剂公司。引物和探针引物：引物：探针：器材微量振荡器、或 荧光 仪及配套的毛细管、微量加样器（、）及配套的带滤芯吸头、高速台式冷冻离心机（离心速度 犵以上）、的离心管、生物安全柜、超纯水系统等。样品制备详见 。犇 犖 犃模板的制备详见 。荧光犘 犆 犚反应 反应体系（犔）引物（浓度为 ）：上下游引物各。或 ：。犛 犖犜 探针：。模板：。加入 的无菌去离子水，混匀，犵以下瞬时离心后置荧光 仪内开始
11、反应。对照组的设置同时设置 阴性对照、阳性对照和空白对照。对照组反应体系中，除模板外其余组成成分与 相同。反应条件预变性 。扩增 ，个循环，在退火延伸时收集各循环的荧光。反应结束后，根据荧光曲线和 值判定结果。结果判定 结果分析条件设定直接读取检测结果。阀值设定原则根据仪器的噪声情况进行调整，以阀值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准。质控标准 阴性对照：无 值或 值 ，并且无扩增曲线。阳性对照：值 ，并且出现典型的扩增曲线。若阴、阳性对照组结果不成立，则视为无效试验。结果描述与判定 若检测样品的 值 或无 值，并且无扩增曲线，则判为阴性。若检测样品的 值 ，并且出现典型的扩增曲线，
12、则判为阳性。若检测样品的 值介于 之间，但扩增曲线显著，或 值 ，但扩增曲线不显著，则建议对样品进行复检。若复检后，结果无变化，则判为阳性；若复检后，值 ，无扩增曲线，或 值介于 之间，但扩增曲线不显著，或 值 ，则判为阴性。犛 犖犜 附录犃（规范性附录）磷酸盐缓冲液（犘 犅 犛）配方以下所用试剂均为分析纯。试验用水应符合 规定。犃 犃液（犿 狅 犾犔磷酸二氢钠水溶液）磷酸二氢钠（），溶于蒸馏水中，最后定容至 。犃 犅液（犿 狅 犾犔磷酸氢二钠水溶液）磷酸氢二钠（）（或 或 ），加蒸馏水溶解，最后定容至 。犃 犿 狅 犾犔、狆 犎 磷酸盐缓冲液的配制 液 液 氯化钠（）用蒸馏水定容至 ，高压灭
13、菌后低温保存（）备用。犛 犖犜 附录犅（规范性附录）试 剂 配 制犅 的 （）：在 双蒸水（或去离子水）中加入 二水乙二胺四乙酸钠（），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠调节溶液的 值至（约需 氢氧化钠颗粒），然后定容至 ，分装后灭菌备用。犅 缓冲液（）：碱 冰乙酸 的 （）犅 缓冲液（）：取 的 缓冲液（），加灭菌双蒸水或去离子水定容至 。犛 犖犜 附录犆（资料性附录）犘 犆 犞 基因组全序列（犫 狆）及内外引物位点 犘（）犮 犪 犪 犮 狋 犵 犮 狋 犵 狋 犮 犮 犮 犪 犵 犮 狋 犵 狋 犪 犵 犘（）狋 犪 犵 犵 狋 狋 犪 犵 犵 犵 犮 狋 犵 狋 犵 犵 犮 犮 狋 狋 犘（）犮 犪 犵 狋 犪 狋 犪 狋 犮 犮 犵 犪 犪 犵 犵 狋 犵 犮 犵 犵 犮 狋 狋 犮 狋 犵 犮 犵 犵 狋 犪 犪 犮 犵 犮 犮 狋 犮 犮 狋 （）犛 犖犜
