1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准?贝类马尔太虫检疫技术规范?发布?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前?言?本标准按照?给出的规则起草?本标准非等效采用了国际动物卫生组织?水生动物疾病诊断手册?版?中?等有关章节?本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口?本标准起草单位?中华人民共和国山东出入境检验检疫局?中华人民共和国厦门出入境检验检疫局?中国检验检疫科学研究院?本标准主要起草人?岳志芹?方绍庆?邓明俊?孔繁德?吴绍强?赵玉然?郑小龙?梁成珠?徐淑菲?徐彪?朱来华?肖西志?贝类马尔太虫检疫技术规范?范围本标准规定了折光马尔太虫的检疫技术规范?本标准适用于折光
2、马尔太虫的分离和鉴定?也适用于该病的流行病学调查?诊断?检疫和监测?规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的?凡是注日期的引用文件?仅注日期的版本适用于本文件?凡是不注日期的引用文件?其最新版本?包括所有的修改单?适用于本文件?分析实验室用水规格和试验方法?设备和材料?设备?普通光学显微镜?组织研磨器?切片机?仪?凝胶成像仪或紫外观察灯?材料?水?组织切片时用的水为?的盐水?做?时所用的水要用超纯水?用水符合?规定?干净的盖玻片?载玻片?若干?涂有氨基烷基硅烷?粘附剂的载玻片?染色剂?常规涂片及组织学染色剂?见附录?酚?三氯甲烷抽提法方法或其他?抽提试剂盒提取组织?见附录?蛋白酶?硫
3、酸镁?聚合酶及?缓冲液?核酸染料?或者新型替代染料如?俾斯麦棕?染液?电泳缓冲液?见附录?引物?固定液?见附录?缓冲液?见附录?溶液?见附录?产物纯化试剂盒?地高辛标记试剂盒?采样?以牡蛎为例其他贝类参照此法?临床采样挑选至少?只濒死的或带有疑似临床症状的活牡蛎个体?年龄?在活体或刚死后分别包装放在密封冷藏的容器中送至实验室?所采集的牡蛎应严格避免冰冻?条件下不宜超过?感染早期的个体一般取其唇的触须和胃?严重感染的个体除取上述的部位外?主要采集消化腺管道及其粪便?监测采样?通用要求当个体怀卵时?应每年在产卵期采集一次卵液?对无临床症状的牡蛎?取其唇的触须和胃?消化道上皮及粪便?成熟雌蛎还需取其
4、卵巢液?样品应包括该地所有的易感品种?参见附录?监测初期的采样要求在?年内每年对该养殖场监测?次?监测时间应选在一年中最能观察到临床症状并能观察到该虫的温度和季节?通常为水温高于?的夏季和秋季?每次采样的牡蛎数量按感染率等于或大于?时检出的概率进行抽样?整体情况下?每次采集?个个体?对怀卵的个体?两次检查中至少有一次要在亲牡蛎中取?份卵巢液样品?对野生?混养的蛎群?至少两年内每年一次采集?个个体?尽可能优先采取幼龄期?老龄及和?或?雌性卵巢液?监测保持期采样的要求经实验室检测?年?无马尔太虫可疑临床症状后?每年还应连续抽检两次?每次采集的样品可减少到?个?并尽可能包括怀卵牡蛎个体?但在检疫中发
5、现有濒死的个体时应采取进一步的实验室检测?马尔太虫病的检测方法?以牡蛎为例?其他贝类参照此法?总则诊断临床感染该病的贝类的理想方法是?或?法直接检测感染组织?然后用压片法?涂片法或组织切片法予以确诊?涂片法?样品的采集取开口的或刚死的牡蛎个体?制片前载玻片的准备新载玻片常带有游离碱质?应用浓度为?的盐酸浸泡?再用清水彻底冲洗?干燥后备用?旧载玻片要在含洗涤剂的清水中煮沸?再用清水反复冲洗?最后用?乙醇浸泡?干燥备用?使用载玻片时?不要用手触及玻片表面?保持玻片清洁?干燥?中性?无油腻?制片方法取一滴消化腺粘液或粪便置载玻片的一端?以边缘平滑的推片一端?从粘液或粪便前沿方向接触粘液或粪便?使其沿
6、推片散开?推片与载玻片保持?夹角?平稳地向前推动?粘液或粪便即在载玻片上形成薄层膜?滴加姬姆萨染?液?滴?滴?固定?然后按?的比例加缓冲液?的磷酸盐缓冲液?用洗耳球吹匀?染色?流水冲洗?晾干?待检?镜检把制好的涂片置于?显微镜上观察?结果判定呈阳性结果的细胞通常大小在?细胞质染色嗜碱性?细胞核染色嗜曙红细胞性?在细胞中出现许多折光的着色颗粒和白色的光环?并且一个细胞内有多个马尔太虫细胞?马尔太虫疫区内的易感种的检测结果阳性通常被认为该机体感染了马尔太虫?非易感种或马尔太虫疫病区外?阳性结果通常要进一步证实?才能下定论?压片法?样品的采集鲜活牡蛎个体?制片前载玻片的准备与涂片法相同?制片方法取一
7、粟米大小病灶消化腺上皮?腮?触须?粪便置于载玻片中央?加入?的盐水取另一载玻片覆盖压紧?用力大小依组织微粒受压后向四周展平的难易而定?快速平行移动拉开?使组织微粒充分展开形成一层薄膜后?不能让其干掉?迅速投入?乙醇中?固定?取出后快速进行苏木精?伊红染色?染色?染色?二甲苯脱蜡?按下列浓度的溶液逐级脱水?二甲苯乙醇一纯乙醇?乙醇?乙醇?乙醇?乙醇?乙醇?除去二甲苯?组织复水?各级?蒸馏水洗?苏木素染色?盐酸乙醇分色数秒?自来水洗约?使细胞核变蓝?乙醇?乙醇?乙醇?乙醇梯度脱水?伊红乙醇溶液染色?乙醇分色?脱水?乙醇脱水?两次共?二甲苯透明?封片?将中性树胶滴于组织片上?加盖玻片后烘干?切片就被
8、封固?镜检把制好的涂片置于最大?显微镜下观察?结果判定呈阳性结果的细胞通常大小在?在唇触须和胃的上皮部位发现早期的单核细胞?参见附录?马尔太虫的孢子通常分布于消化腺小管和排泄管的细胞内?折光颗粒出现在孢子形成后?早期观察不到它?在感染的后期游离的孢子常出现在消化道腔内?细胞质染色嗜碱性?细胞核染色嗜曙红细胞性?折光体颗粒颜色由深橙色到深红色?马尔太虫疫区内易感种的检测结果阳性通常被认为该机体感染了马尔太虫?其他非易感种或在马尔太虫疫区外?检测结果阳性需要进一步证实?才能下定论?法?样品的采集活牡蛎或刚死的牡蛎个体?取其消化腺上皮?腮?触须等置于?冰箱中备用?的提取样品?的提取可采用动物组织基因
9、组通用试剂盒按说明书提取?也可采用常规抽提法?见附录?反应体系在?反应体系中?加入?缓冲液?聚合酶?引物各?模板?补充水至?若检测人员使用的是合格供应商提供的?试剂盒?请按照?试剂盒说明书操作?扩增程序?反应程序为?预变性?变性?退火?延伸?共?个循环?最后?延伸?琼脂糖电泳用电泳缓冲液?见附录?制备?的琼脂糖凝胶平板?将平板放入水平电泳槽?使电泳缓冲液刚好淹没胶面?向?扩增产物中加入?体积的电泳上样缓冲液?上样缓冲液?混匀后加到样品孔?在电泳时设立?做对照?电泳约?当溴酚蓝到达一定位置时停止?在紫外灯下或凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性?电泳带?拍摄并记录?确诊前需要进行?
10、产物测序?设立对照?阳性对照?阳性对照可从?推荐的实验室中获取?阴性对照?阴性对照可从?推荐的实验室中获取?空白对照?取等体积的水代替模板作为空白对照?结果判定实验中阳性对照有?的扩增条带?阴性对照及空白对照没有相应片段的?产物?在阳性对照?阴性对照?空白对照都成立的前提下?若检测样品有?的条带?则?结果阳性?若检测样品无?的条带?则?结果阴性?扩增序列参见附录?在马尔太虫疫区内易感种的?阳性结果后?若经组织学或涂片法诊断结果为阳性?则认为该机体感染了马尔太虫?其他非易感种或在马尔太虫疫病区之外?若?检测结果阳性?且组织学或涂片法检测也为阳性结果?可确诊为感染马尔太虫?原位杂交法?样品的采集活
11、牡蛎或开口牡蛎?地高辛标记?探针的制备首先用?方法扩增马尔太虫?基因?在?反应体系中?加入?缓冲液?聚合酶?引物各?马尔太虫基因组?补充水至?若检测人员使用的是合格供应商提供的?试剂?请按照?试剂盒说明书操作?反应程序为?预热?变性?退火?延伸?共?个循环?最后?延伸?用?产物纯化试剂盒对?产物进行纯化?再利用地高辛标记试剂盒进行标记?得到地高辛标记的?探针?探针序列参见附录?样品处理?固定取贝类内脏团用?固定液固定?石蜡包埋?组织切片厚?粘附于涂有粘附剂氨基烷基硅烷?粘附剂的载玻片上?烘烤过夜?使切片更紧贴玻片?脱蜡切片在二甲苯中脱蜡?并重复一次?无水乙醇中浸泡?重复一次?切片按照?乙醇?乙
12、醇?乙醇?乙醇?乙醇梯度浸泡?蛋白酶处理用蛋白酶?用?的?缓冲液溶解?处理?用微量移液器将组织切片上的蛋白酶?工作液吸干?脱水通过乙醇梯度洗脱?进行脱水?空气晾干?杂交切片用含有?地高辛标记的探针的杂交缓冲液?甲酰胺?溶液?酵母?硫酸葡聚糖?浸泡?切片用原位杂交塑料片覆盖?水浴箱密封盒中变性?变性完毕将切片放在冰块上迅速降温?然后将切片移入湿盒内?杂交过夜?杂交后漂洗将杂交玻片从湿盒?或杂交仪?中取出?室温下用?洗脱?次?每次?洗?次?显色将切片置于?中漂洗用俾斯麦棕复染?染色后再?用漂洗?最后切片用水溶性的封固剂封片保存?设立对照?阳性对照?用感染马尔太虫的寄主进行原位杂交?阴性对照?设立两
13、个阴性对照?用原位杂交过程中不加入探针?非感染的寄主分别进行原位杂交?结果判定阳性对照组织切片在显微镜下观察有紫黑色的杂交信号?阴性对照无紫黑色的杂交信号?在阳性对照?阴性对照成立的条件下?检测样品通过探针杂交染色后有紫黑色信号的切片被认为阳性结果?在马尔太虫分布的地理范围内易感种的原位杂交阳性结果可以确认该机体感染了马尔太虫?其他非易感种或无马尔太虫分布的地理范围内的马尔太虫感染?原位杂交阳性结果被确诊为感染了马尔太虫?参见附录?综合判定标准?疑似病例的判定标准?若为易感种?且在马尔太虫疫病区内?压片法?涂片法或?方法有一项检测结果为阳性?则判定为疑似病例?若为非易感种?或在马尔太虫疫病区外
14、?组织学方法或?法检测为阳性结果?则判定为疑似病例?确诊病例的判定标准?若是易感种?且在马尔太虫疫病区内?满足下列条件之一可确诊?组织学法或原位杂交法检测?结果为阳性?检测为阳性?经组织学或原位杂交法检测结果为阳性?压片法或涂片法检测为阳性结果?经?法测序检测结果为阳性?若是非易感种?或者是易感种但在马尔太虫疫病区外?经组织学法?原位杂交法和?检测法中的两种检测为阳性即可确诊?附?录?规范性附录?样品处理?的抽提及试剂配制方法?样品处理将新鲜贝类的消化腺上皮?腮?触须等组织置于冰冷的生理盐水中反复冲洗?滤纸吸干表面水分后称量?根据需要?置于匀浆研磨器中并加入冷的生理盐水?进行手工匀浆研磨?注意
15、整个过程在冰上完成?的抽提?将?匀浆液倒入?塑料离心管中?加?蛋白酶?再加?至终浓度为?上下颠倒混匀?混合液置于?水浴?水浴?向匀浆液中按?比例加酚?三氯甲烷?异戊醇混合液?轻轻振荡混匀?离心?吸上层水相?于一灭菌塑料离心管中?加入等体积酚?三氯甲烷?异戊醇混合液?轻轻振荡混匀?离心?吸上层水相?于一塑料离心管中?加入两倍体积的无水乙醇?放置?或液氮中放置?离心?沉淀?倾去上清液?于沉淀中加入?乙醇溶液?轻轻混匀后?离心?倾去上清液?室温凉干?向?沉淀中加?缓冲液?保存备用?或者采用等效的?提取试剂盒?按照说明书进行操作?改良?苏木精染液的配制方法苏木精?无水乙醇?硫酸铝钾?蒸馏水?碘酸钠?甘
16、油?冰乙酸?分别用无水乙醇溶解苏木素?蒸馏水溶解硫酸铝钾?然后两液混合后?依次加入碘酸钠?甘油和冰乙酸?俾斯麦棕液俾斯麦棕?溶于?蒸馏水?加?乙醇至?水浴中加热溶解?电泳缓冲液?硼酸?加蒸馏水至?用?的盐酸调制?用蒸馏水配成?的浓缩液?用时每?电泳液或琼脂糖凝胶中加入?固定液甘油?福尔马林?乙醇?冰乙酸?加?至?氯化钠?柠檬酸钠?加入约?的去离子水?充分搅拌溶解?滴加?盐酸?调节?值至?后?加去离子水将溶液定容至?高温高压灭菌后?室温保存?溶液?加去离子水定容至?用?滤膜过滤后?分装成每份?保存?附?录?资料性附录?马尔太虫疫病的概述?疫病概述马尔太虫病是由折光马尔太虫引起的寄生性感染病?常感染欧洲牡蛎和牡蛎属?依照环境的不同可存活?周?周?中间寄主?目前尚未发现其他中间寄主?马尔太虫地理分布范围较广?如克罗地亚?法国?希 腊?意 大 利?摩 洛 哥?葡 萄 牙 及 西 班 牙?马 尔 太 虫 主 要 感 染 欧 洲 牡 蛎?中国鹑螺?安加西牡蛎?贝壳属牡蛎?贻贝属的紫贻贝及地中海贻贝等水生软体动物?早期折光马尔太虫感染出现在宿主唇的触须和胃的部位?孢子在消化腺的管道内形成?繁殖体释放
