1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3088-2012非洲柑桔黄龙病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Candidatus Liberobacter africanum(Jagoueix et al.2012-05-07发布2012-11-16实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布SN/T3088-2012前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局、中华
2、人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：龙海、李一农、李芳荣、冯建军、朱金国、王振华、高文娜，郑耘、龚强。SN/T3088-20123.9SDS Dodecyl sulfonic acid sodium salt十二烷基磺酸钠。3.10EB ethidium bromide溴化乙锭。4原理4.1非洲柑桔黄龙病菌的分类地位学名Candidatus I,iberobacter africanum属于变形菌门Proteobacteria,a-变型菌纲Alphaproteobacteria根瘤菌目Rhizobiales,根瘤菌科Rhizobiaceae,韧皮部杆菌属Candidatus Li
3、beribactor。属内与其近似的病原菌有亚洲柑桔黄龙病菌C.L,iberobacter asiaticum、美洲柑桔黄龙病菌C.Liberobacter americanum.4.2传播途径病原可以通过嫁接或菟丝子(Cuscuta cam pestris)传播，但不能通过汁液和土壤传播，通过带病的苗木、接穗和果实等进行远距离传播。自然传播介体为非洲柑桔木虱(Trioza erytreae)。4.3鉴定依据在检疫现场抽取接穗样本，在实验室中提取样本的核酸，用特导性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，根据PCR扩增结果对种类进行判是5器材和试剂5.1器材可封口塑料袋、标签、白磁、研体、碾棒、
4、不锈钢勺、PCR管、离心管、PH计、移液枪(1O00L可调、200L可调、20L可调、2.5L可调)、恒温水浴锅超净工作台、低温冷冻离心机、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、电子天平、高压火菌锅、低温冰箱。5.2试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯和生化级试剂。实验用水均为超纯水，规格符合GB/T6682相关规定。CTAB抽提缓冲液（见附录B)、液氮、20%SDS、5mol/L醋酸钾(KAc)、75%乙醇、95%乙醇、灭菌水、电泳缓冲液、苯酚、三氯甲烷（氯仿）、异戊醇、异丙醇、引物A2/J5、10PCR缓冲液(Mg2+free)、TaqDNA聚合酶、dNTPs(含dATP、dTTP,dGTP、
5、dGTP)、氯化镁(MgCl,)、DL2oo0 Marker、琼脂糖、EB.6检测与鉴定6.1检测样品的准备检测样品：待检接穗选择枝条的韧皮部约2.0g,用无菌水冲洗干净。2SN/T3088-2012阳性对照样品：取被非洲柑桔黄龙病菌感染的柑桔叶脉约2.0g,用无菌水冲洗干净。阴性对照样品：取健康的柑桔叶脉约2.0g,用无菌水冲洗干净。6.2样品核酸的提取将准备好的检测样品和对照样品各0.5g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌水冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，加入2.0mL65预热的CTAB抽提缓冲液，将混合液转移到灭菌的2.0 mL Eppendorf管中。65水浴1h,每
6、隔l0min轻摇一次，12000r/min离心15min,取上清液，加入等体积的苯酚/三氯甲烷/异戊醇(25：24：1)混匀，12000r/min离心10min,取上清液，加入等体积的异丙醇，一20放置30min,12000r/min离心10min,弃去上清液，保留沉淀，加入600L75%乙醇洗涤基因组DNA,12000r/min离心5min,弃去上清液，保留沉淀，加入600L95%乙醇洗涤基因组DNA,l2000r/min离心5min,弃去上清液，沉淀自然晾干，加入适量的灭菌水或TE缓冲液溶解DNA。6.3PCR扩增6.3.1扩增引物（引自Hocquellet et al.,1999)上游引
7、物A2:5-TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT-3下游引物J5:5-ACAAAAGCAGAAATAGCACGAACAA-36.3.2PCR扩增体系和程序PCR扩增体系(25uL)中各成分依次为1XPCR缓冲液(Mg+ree),MgCl22.5mmol/L,dNTPs200umol/L,上游引物A20.2umol/L,下游引物J50.2mol/L,Tag DNA聚合酶1.0U,模板DNA1.0L,灭菌水补足总体积至25L。柑桔感病叶脉样品核酸做阳性对照，健康叶脉样品核酸做阴性对照，超纯水做空白对照。扩增程序为：94、5min94、30s,6230s,72、1min重复35个循环：7
8、2延伸10min。6.3.3琼脂糖凝胶电泳用2.0%琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色，凝胶成像系统观察，拍照6.3.4PCR扩增结果评定电泳成像结果，如果阳性对照和检测样品核酸均出现G69bp的预期条带，而阴性对照和空白对照无669bp的预期条带，则判定检测结果为阳性；阳性对照出现预期条带而阴性对照、空白对照和检测样品核酸均无预期条带，则判定检测结果为阴性。7结果判定根据PCR扩增结果，如果阳性对照样品和待测样品出现669bp的预期条带，阴性对照样品和空白对照无669bp的预期条带出现，则判定测试样品中含有非洲柑桔黄龙病菌；如果阳性对照样品出现669bp的预期条带，检测样品、阴性对照样品和空白对照无669bp的预期条带出现，则判定测试样品中不含有非洲柑桔黄龙病菌。8样本保存和复核样品保存6个月，发现非洲柑桔黄龙病的样品保存1年。柑桔接穗经液氮处理后在一20条件下保存。检测的原始记录、照片、文档按有关规定做好登记、标识和存档，以备必要时复核。3
