1、细胞培养技术细胞培养技术 细胞培养也叫细胞克隆技术。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是从细胞得来，所以细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。最核心、最基础的技术。什么是细胞培养？什么是细胞培养？主要内容主要内容 实验设备实验设备 试剂及耗材试剂及耗材 清洗及灭菌清洗及灭菌 细胞培养细胞培养 （细胞生长过程，细胞来源，细胞复苏、传代及冻存，细胞计数，活力测定，细胞污染）一一 实验设备实验设备 超净工作台，生物安全柜 CO2培养箱 倒置显微镜 离心机 电热恒温水槽 液氮罐 纯水仪 压力蒸汽消毒器 电热干燥箱 超净台超净台 生物安全柜生物安全柜 酒精灯（酒精灯（），），
2、离开要熄灭离开要熄灭 ！酒精灯（酒精灯（）CO2培养箱培养箱 CO2培养箱设定的条件为37，5CO2。倒置显微镜倒置显微镜 离心机离心机 电热恒温水槽电热恒温水槽 液氮：-196 液氮罐液氮罐 纯水仪纯水仪 压力蒸汽灭菌器压力蒸汽灭菌器 电热干燥箱电热干燥箱 由工作人员操作，注意安全！由工作人员操作，注意安全！小结一小结一 实验设备及功能实验设备及功能 超净工作台，生物安全柜-CO2培养箱-倒置显微镜-离心机-电热恒温水槽-液氮罐-纯水仪-压力蒸汽消毒器-电热干燥箱-（酒精灯安全）（酒精灯安全）二二 试剂及耗材试剂及耗材 培养基培养基 缓冲液缓冲液 消化液消化液 血清血清 其他其他 耗材耗材
3、培养基培养基 供给细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。成分及作用：成分及作用：氨基酸：组成蛋白质的基本单位 碳水化合物：能量来源 无机盐：帮助细胞维持渗透压平衡 维生素：维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用 培养基分类培养基分类 DMEM（高糖高糖，葡萄糖4500 mg/L）：成纤维、上皮细胞（293），一些实体瘤（Panc-1），原代神经元 DMEM（低糖低糖，葡萄糖1000 mg/L）：间充质干细胞，单抗细胞融合 RPMI 1640：血液细胞（HL60）、一些实体瘤细胞（BT474）酚红：酚红：PH指示剂（黄色过酸、紫色过碱）；酚红可以模
4、拟固醇类激素的作用（特别是雌激素），涉及到激素和诱导的实验，建议选用无酚红培养基。ATCC https:/www.atcc.org/美国模式培养物集存库 缓冲液（洗涤细胞）缓冲液（洗涤细胞）PBS：磷酸缓冲盐溶液具有pH缓冲作用的等渗盐溶液（常规实验皆可用）。（Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl）D-PBS：杜氏磷酸缓冲液，磷酸盐含量稍低，含有钙镁离子，用于胚胎学方面的研究。Hanks：平衡盐溶液无机盐和葡萄糖浓度接近大部分动植物细胞的水平，可作为动植物细胞短期培养(几个小时)。D-Hanks：不含钙离子、镁离子、葡萄糖（使用消化液时）。消化液消化液 胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液 使细
5、胞间蛋白质水解、细胞离散。使用浓度0.25%。配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清（对胰酶产生抑制作 用）的平衡盐溶液（如PBS、D-Hanks）。EDTA溶液溶液 一般用其钠盐，可溶性较好。有些组织需要Ca2+、Mg2+来保持其完整性，EDTA可以螯合这些离子，可使细胞之间裂解。其作用比胰蛋白酶缓和。使用浓度为0.02%，以无钙、镁的平衡盐溶液配制。胶原酶溶液胶原酶溶液 主要水解结缔组织中胶原蛋白成分（用胰蛋白酶效果较差），使用Hanks溶液配置，常用剂量为最终浓度200U/ml（约为1mg/mL）。提供基本营养物质提供基本营养物质、激素和各种生长因子激素和各种生长因子、提供结合蛋白提供结
6、合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤壁免受机械损伤、对培养中的细胞的起到某些保对培养中的细胞的起到某些保护作用护作用。保存血清最好的方法保存血清最好的方法？建议血清保存在-20。解冻后存放于4时，请勿超过一个月。（分装）如何解冻血清才不会使产品质量受损如何解冻血清才不会使产品质量受损?建议从冷冻箱取出后，置于28冰箱使之缓缓慢解冻慢解冻、融解融解。使用时，必须将解冻的血清充分充分混匀混匀，并且勿将血清置于37太久。血清血清 青霉素青霉素-链霉素溶液链霉素溶液 青霉素的工作浓度为100 U/ml，链霉素的工作浓度为0.1 mg/ml。分别阻止细菌细胞壁合
7、成及细菌蛋白质的组成，达到抑制细菌生长的作用，防止污染，对真菌和支原体无效。其他实验所需的试剂其他实验所需的试剂：药物（如ATRA）、检测试剂（如MTT）、细胞因子（如SCF）等 试剂标注规范试剂标注规范 试剂名称 NaCl 配制浓度 0.5 mM 配制人 张三 配制日期 2016.10.21 耗材耗材 培养皿、瓶、孔板 离心管、移液管 枪尖 其他 小结二小结二 试剂及耗材的分类及用途试剂及耗材的分类及用途 培养基（成分、分类）缓冲液（PBS、Hanks等）消化液（分类及应用）血清（作用、存储及解冻方法）试剂标签要规范 耗材（分类、用途）在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感在组织
8、细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长均能影响培养细胞的生长 微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质 需要清洗的培养用品需要清洗的培养用品:玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。（包括：浸泡（洁消精）、超声波清洗、冲洗、烘干四个步骤）三三 清洗及灭菌清洗及灭菌 消毒灭菌方法消毒灭菌方法 物理消毒灭菌法物理消毒灭菌法 Co60辐射辐射（射线射线）：破坏生物大分子（塑料制品）紫外线紫外线（200-300 nm）：30min，阻止阻止细菌细菌、病毒病毒核酸合成核酸合成。（细胞室：细胞室：用于空气用于空气，操作台表面等操作台表面等）湿热湿热（高压蒸气灭菌法高
9、压蒸气灭菌法）：121，20min，破坏微破坏微生物孢子生物孢子、蛋白变性蛋白变性。（用于大量液体用于大量液体、玻璃器皿玻璃器皿、部分塑料耗材部分塑料耗材、手术器械等手术器械等，由工作人员操作由工作人员操作）干热：干热：160,2 小时，高热作用下的氧化作用破坏微生物（耐高温的玻璃和金属制品）过滤：过滤：0.22m滤膜过滤除菌（少量试剂）消毒灭菌方法消毒灭菌方法 化学消毒灭菌法化学消毒灭菌法 75%酒精 主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理（蛋白凝固）（不能擦拭有机玻璃）1新洁尔灭 主要用于器械的浸泡，皮肤和操作室壁面的擦试消毒（阳离子表面活性剂，能破坏细胞膜，改变其通透性而起
10、杀菌作用）需要清洗的物品：玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。清洗的步骤 灭菌的方法：-紫外线（超净台、生物安全柜）-高压蒸汽灭菌（准备好放在准备室502）-75%酒精（表面消毒，小心酒精灯明火）小结三小结三 清洗及灭菌清洗及灭菌 四四 细胞培养细胞培养 生长类型 细胞来源 细胞复苏 细胞传代 细胞冻存 细胞计数 活力测定 污染种类 细胞的生长类型细胞的生长类型 粘附型粘附型细胞细胞：附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。（绝大多数正常细胞及实体瘤细胞）悬浮型悬浮型细胞细胞：不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。（主要是白血病细胞等）小鼠单核巨噬细胞 白血病细胞 细胞贴壁过程
11、细胞贴壁过程 每代贴壁细胞的生长过程每代贴壁细胞的生长过程 游离期游离期（接种后在培养液中呈悬浮状态，细胞质回缩，细（接种后在培养液中呈悬浮状态，细胞质回缩，细胞体圆球形）胞体圆球形）贴壁期贴壁期（细胞平均在（细胞平均在10分钟分钟4小时贴壁小时贴壁，底物：胶原、玻，底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等）璃、塑料、其它细胞等）潜伏期潜伏期（有生长活动，而无细胞分裂，一般为（有生长活动，而无细胞分裂，一般为624小时小时 对数生长期对数生长期（细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳。（细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳。最适合进行实验研究最适合进行实验研究）停止期（平台期）（停止期（平台期）（细胞长满
12、瓶壁后，细胞虽有活力但不细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性）再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性）（悬浮细胞没有贴壁过程）（悬浮细胞没有贴壁过程）国内可以买到细胞株的地方有哪些？国内可以买到细胞株的地方有哪些？ATCC（美国模式培养物集存库）国内代理 ECACC（欧洲细胞株、微生物保藏中心）国内代理、sigma 中国科学院细胞研究所 中国医学科学院（协和医科大学）基础医学部 武汉大学冷藏中心等 细胞来源细胞来源 确定细胞株的培养信息（确定细胞株的培养信息（ATCC）配制培养基（基础培养基配制培养基（基础培养基+10%胎牛血清胎牛血清+双双抗）、胰酶、抗）、胰酶、P
13、BS 无菌培养瓶、吸管、离心管的准备无菌培养瓶、吸管、离心管的准备 准备工作准备工作 细胞复苏（快融）细胞复苏（快融）（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37水浴中，使其融化（1分钟左右）。并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。（2）用培养液稀释后低速离心10分钟。（3）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。（4）隔天换液，但贴壁细胞若未贴壁则勿需处理。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶而损伤细胞。细胞传代细胞传代 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用
14、培养细胞进行各种实验的必经过程。细胞传代细胞传代 1 悬浮细胞传代悬浮细胞传代 离心法传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶底时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2 半贴壁细胞传代半贴壁细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。离心 新鲜培养基悬浮 铺板 细胞传代细胞传代 3 贴壁细胞传代贴壁细胞传代 采用酶消化法传代。常用的0.25的胰酶。吸掉上清，加入PBS缓冲液洗涤，弃掉洗液，加入适量胰酶消化液，37消化1分钟
15、左右，加入含血清的培养基终止消化，并离心去上清，重新稀释后接种。注意：开放式操作开放式操作，小心谨慎小心谨慎、谨防污染谨防污染！细胞冻存（慢冻）细胞冻存（慢冻）1 细胞冻存液（细胞冻存液（1ml/管）管）基础培养基70 胎牛血清20 DMSO 10（二甲基亚砜，一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶对细胞的损伤。）2 细胞欲冷冻保存时，细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1-8x106 cells/ml 缓慢冷冻，可使细胞逐步脱
16、水，细胞内不致产生大的冰晶。细胞冻存细胞冻存 3 慢冻程序慢冻程序 传统方法：4 10分钟-20 30 分钟 -80 1618 小时（或过夜）液氮长期保存。程序降温盒：利用异丙醇实现梯度降温（易挥发，并且易吸收空气中的水分，冷冻过程中可以辅助实现缓慢降温，每十分钟降一度）。细胞冻存细胞冻存 小结四小结四 细胞培养过程细胞培养过程 细胞生长类型及传代方法 细胞培养过程培养过程 注意无菌操作无菌操作（全程）准备工作准备工作 复苏（快）复苏（快）传代（无菌）传代（无菌）冻存（慢）冻存（慢）实验实验 细胞信息、细胞信息、方法方法 冻存液成分、冻存液成分、培养基、耗材培养基、耗材 程序程序 细胞计数细胞计数 血细胞计数器：手工计数细胞血细胞计数器：手工计数细胞 细胞计数细胞计数 计算公式：细胞数/ml4大格细胞总数/4稀释倍数 104 细胞计数细胞计数 注意事项注意事项 记上不记下，记左不记右。吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡。镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。培养细胞活力测定培
