1、 传染病信息 2023 年 6 月 30 日 第 36 卷 第 3 期 Infect Dis Info,Vol.36,No.3,June 30,2023 248流感嗜血杆菌多位点序列分型及同源性分析张 静，王姣贤，董 蓉，丁赔赔，李艳君 摘要 目的 了解流感嗜血杆菌耐药率变化及多位点序列分型，进行同源性分析，减少医院感染和多重耐药菌株的发生。方法 收集解放军总医院第六医学中心 20152022 年临床分离的 108 株流感嗜血杆菌，使用 K-B 法进行药物敏感性试验；采用多位点序列分析进行序列分型（sequence typing,ST）；采用 MEGA 7.0 软件的 Neighbor-Joi
2、ning 法和Phyloviz 8.0 软件的 goeBURST 算法构建系统发育树和最小生成树分析菌株同源性。结果 近几年流感嗜血杆菌对氨苄西林、复方新诺明耐药率 60%；108 株菌中，5 株未能与数据库匹配，103 株菌有 20 种 ST 型别，主要为 ST-487（58 株，占 53.70%）和 ST-147（19 株，占 17.59%）；系统发育树分为 2 组，除 ST-834 和 ST-1242 2 种型别分布在组外，其余型别在组；最小发育树提示 2 大分支 ST-487 和 ST-147 都与 ST-103 有相关性。结论 院内分离的流感嗜血杆菌多数菌株存在亲缘进化关系；多重耐药
3、的流感嗜血杆菌在我院不同科室相继检出，提示编码耐药基因的质粒在病区间传播。关键词 流感嗜血杆菌；多位点序列分析；同源性；耐药率；氨苄西林；医院感染；系统发育树；最小生成树 中国图书资料分类号 R378.4 文献标志码 A 文章编号 1007-8134(2023)03-0248-05DOI:10.3969/j.issn.1007-8134.2023.03.011Multilocus sequence typing and homology analysis of Haemophilus influenzaeZHANG Jing,WANG Jiaoxian,DONG Rong,DING Peipe
4、i,LI Yanjun*Clinical Laboratory,Beijing Mentougou District Hospital,102399,China;Clinical Laboratory,the Sixth Medical Center of PLA General Hospital,Beijing 100048,China*Corresponding author,E-mail:AbstractObjectiveTo investigate the variation in drug resistance rate and multilocus sequence typing
5、of Haemophilus influenzae and analyze homology to reduce hospital-acquired infections and multidrug-resistant strains.Method One hundred and eight strains of H.influenzae clinically isolated from the Sixth Medical Center of Chinese PLA General Hospital between 2015 and 2022.Drug sensitivity tests we
6、re conducted using the K-B method,and multilocus sequence analysis was used to sequence typing.We utilized the Neighbor Joining algorithm of MEGA 7.0 software and the goeBURST algorithm of Phyloviz 8.0 software to construct phylogenetic trees and a minimum spanning tree to analyze strain homology.Re
7、sults In recent years,the resistance rate of H.influenzae to ampicillin and compound sulfamethoxazole has exceeded 60%.Among the 108 strains of bacteria,5 were not matched with the database,and 103 strains showed 20 ST types,mainly ST-487(58 strains,53.70%)and ST-147(19 strains,17.59%).The phylogene
8、tic tree analysis was divided into 2 groups,with ST-834 and ST-1242 types distributed in Group II,and the remaining types in Group I.The minimum developmental tree analysis indicated that both branches ST-487 and ST-147 are correlated with ST-103.Conclusions Most strains of H.influenzae isolated in
9、hospital show phylogenetic relationships.Multidrug-resistant H.influenzae have been detected in different departments,suggesting that the drug resistance genes are being transmission between affected areas.Keywordshaemophilus influenzae;multilocus sequence analysis;homology;drug resistance rate;ampi
10、cillin;hospital infections;the phylogenetic tree;the minimum spanning tree 基金项目 国家重点研发计划课题级（2022YFB3204404）作者单位 102399，北京市门头沟区医院检验科（张静）；100048 北京，解放军总医院第六医学中心检验科（张静、王姣贤、董蓉、丁赔赔、李艳君）通信作者 李艳君，E-mail: 流感嗜血杆菌属于嗜血杆菌属，是一类无动力的革兰阴性杆菌1。感染人体不同部位时可出现不同的症状，轻则咳嗽、发热、气促，重则引起肺炎、化脓性脑膜炎等各类疾病2-3。近年来，我院流感嗜血杆菌检出率逐渐上升，菌株对
11、抗菌药物耐药率不断上升。本研究收集临床分离的流感嗜血杆菌，采用多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）方法，确定菌株的序列分型（sequence typing,ST），进一步分析各型别间遗传进化关系，降低耐药菌株检出并减少医院感染的发生。1 材料和方法1.1 菌株来源 收集解放军总医院第六医学中心2015 年 1 月2022 年 2 月临床分离的所有流感嗜血杆菌样本，剔除同一患者同一年份相同标本类型的菌株，20152022 年菌株数量依次为 6 株、7 株、4 株、2 株、16 株、20 株、30 株和 23 株，共 108 株。其中 77 株来自男性，
12、31 株来自女性。菌株-80 保存。1.2 仪器与试剂 使用安图生物的巧克力平板进行菌株分离；使用赛默飞的药物敏感性（药敏）纸片进行药敏试验；使用德国 Bruker Daltonik GmbH 的全自动快速生物质谱检测系统进行菌种鉴定；使用天漠生物的细菌 DNA 提取试剂盒提取菌株 DNA；使 用 NEB 的 Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 和ABI 的 Proflex 进行 PCR 检测；使用北京索莱宝科技有限公司提供的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行产物分纯；使用 Bio-Rad 的 Chem Doc 进行化学成像。1.3 方法1.3.1 流感嗜血杆菌的复苏与鉴定
13、将冻存的流感嗜血杆菌复苏，接种于巧克力琼脂平板。在37，传染病信息 2023 年 6 月 30 日 第 36 卷 第 3 期 Infect Dis Info,Vol.36,No.3,June 30,2023 249含有 5%的 CO2的环境中孵育 18 24 h。从培养基中挑取无色、透明、湿润的单个菌落进行质谱鉴定。1.3.2-内酰胺酶检测 使用头孢硝基噻吩纸片，刮取平板上少量形态典型的菌株，若 5 min 内纸片变成红色则为阳性，不变红则为阴性。1.3.3 药敏试验 流感嗜血杆菌采用 K-B 纸片法做常用抗菌药物的药敏试验，试验结果依据 2022年 CLSI 判断标准执行；质控菌株为标准菌株
14、ATCC49247。我院常用的药敏试验药物为：氨苄西林、复方新诺明、克拉霉素、环丙沙星、阿莫西林/棒酸、头孢他啶、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、四环素和氯霉素。1.4 流感嗜血杆菌的 MLST 分型1.4.1 DNA 提取 利用细菌 DNA 提取试剂盒提取流感嗜血杆菌的基因组 DNA。1.4.2 引物设计 依据参考文献 4 设计针对流感嗜血杆菌的 7 对引物，分别为 adk、atpG、frdB、fucK、mdh、pgi、recA，引物序列见表 1。表 1 流感嗜血杆菌基因引物Table 1 Details of loci used in MLST scheme引物引物序列(5-3)扩增片段大小(
15、bp)adkup-GGTGCACCGGGTGCAGGTAA477dn-CCTAAGATTTTATCTAACTCatpGup-ATGGCAGGTGCAAAAGAGAT447dn-TTGTACAACAGGCTTTTGCGfrdBup-CTTATCGTTG GTCTTGCCGT489dn-TTGGCACTTTCCACTTTTCCfucKup-ACCACTTTCGGCGTGGATGG345dn-AAGATTTCC CAGGTGCCAGAmdhup-TCATTGTATGATATTGCCCC405dn-ACTTCTGTACCTGCATTTTGpgiup-GGTGAAAAAAT CAATCGTAC468dn
16、-ATTGAAAGACCAATAGCTGArecAup-ATGGCAACTCAAGAAGAAAA426dn-TTACCA AACATCACGCCTAT 注：up.上游引物；dn.下游引物 1.4.3 PCR 扩增 反应体系为 Q5 高保真酶 0.5 l、Q5 Buffer（5 倍稀释）10 l、dNTP（10 mM）2 l、上游引物和下游引物各 2 l、基因组 DNA 1 l，去离子水补充至 50 l。循环参数设置为：98 30 s；98 10 s，53 20 s，72 30 s 进行 5 个循环；98 10 s，55 20 s，72 3 min 进行 30 个循环；72 5 min；2 1 min。1.4.4 电泳 将扩增产物进行电泳，若电泳结果存在非特异性条带，须将目的条带切出，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化。1.4.5 测序及 ST 分型 将 108 株流感嗜血杆菌的扩增产物测序，结果上传至网站得出每株菌的 7 个等位基因，等位基因再按照 adk、atpG、frdB、Fuck、mdh、pgi 和 recA 的顺序获得 ST 型别（https:/pubmlst.org/hinflu
