1、拉曼光谱检测糖皮质激素的方法研究范宇华1，付芸1，李浩然1，万楚琦2（1.长春理工大学光电工程学院，长春130022；2.长春理工大学空间光电技术研究所，长春130022）摘要：针对市场上出现的非法添加糖皮质激素的问题，以糖皮质激素中地塞米松和氢化可的松为研究对象，对其拉曼光谱展开了定量分析。首先，采用 coif3 小波基、3 层分解的小波硬阈值法去噪。其次，应用 BEADS 算法进行基线校正。再以 31 的比例划分训练集和测试集，用连续投影法提取了 4 个拉曼特征波数。最后，基于 RBF 核函数建立支持向量回归模型取得较好的分析性能，预测集的决定系数（RP2）分别为 0.994 4 和 0.
2、995 9，预测集的均方根误差（RMSEP）分别为 2.527 4 mgmL-1和 1.750 4 mgmL-1，可见模型的预测准确性较高。实验证明拉曼光谱检测法能够作为一种精准检测糖皮质激素浓度的新方法。关键词：拉曼光谱；糖皮质激素；支持向量回归；定量分析中图分类号：O657.3文献标志码：A文章编号：1672-9870（2023）02-0046-09Research on the Method of Glucocorticoid Detectionby Raman SpectroscopyFAN Yuhua1，FU Yun1，LI Haoran1，WAN Chuqi2（1.School o
3、f Opto-Electronic Engineering，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022；2.Institute of Space Optics Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）Abstract：In response to the problem of illegal addition of glucocorticoids in the market，dexamethasone
4、and hydrocortisoneamong glucocorticoids were studied and their Raman spectra were quantitatively analyzed.First，the wavelet hard threshold-ing method with coif3 wavelet basis and 3-layer decomposition is used to denoise the wavelets.Second，the BEADS algo-rithm is applied for baseline correction.Furt
5、her，the training and test sets were divided in a ratio of 31，and four Ramanfeature wave numbers were extracted using the continuous projection method.Finally，the support vector regression modelbased on the RBF kernel function achieved better analytical performance with the coefficient of determinati
6、on（RP2）of0.994 4 and 0.995 9 for the prediction set and the root mean square error（RMSEP）of 2.527 4 mgmL-1and 1.750 4 mgmL-1for the prediction set，respectively，which showed that the prediction accuracy of the model was high.It was demon-strated that Raman spectroscopy can be used as a new method for
7、 accurate detection of glucocorticoid concentrations.Key words：Raman spectra；glucocorticoid；support vector regression；quantitative analysis糖皮质激素（Glucocorticoids，GLUs）是一种类固醇激素1，可从人体的肾上腺皮质分泌，也可人工合成。糖皮质激素不仅在生物体内的糖、蛋白质和脂肪等合成及代谢过程中起着重要的长春理工大学学报（自然科学版）Journal of Changchun University of Science and Technol
8、ogy（Natural Science Edition）Vol.46No.2Apr.2023第46卷第2期2023年4月范宇华，等：拉曼光谱检测糖皮质激素的方法研究收稿日期：2022-02-24基金项目：吉林省重点科技计划项目（20170204015GX，20180201049YY）；高等学校学科创新引智计划（D21009）作者简介：范宇华（1996-），女，硕士研究生，E-mail：通讯作者：付芸（1971-），女，博士，副教授，硕士生导师，E-mail：linda_调 节 作 用2，在 药 用 方 面 也 体 现 着 重 要 的 价值3，如一定量的糖皮质激素能起到抗炎的作用，可抑制毛细血管
9、扩张、缓解水肿；还可调节体温，缓解多种症状引起的发热；还有抗过敏的作用4。但近年来，糖皮质激素滥用5-6现象广泛存在，如大剂量、长周期使用糖皮质激素，引发依赖性；把糖皮质激素随意当作退热药、镇痛药和抗菌药使用；或用在诊断不明的病例上缓解症状；更有甚者在商品中违禁添加糖皮质激素，如动物饲料7、化妆品8中等。但糖皮质激素的滥用会引发人体免疫功能障碍6，如体内淋巴细胞的数量下降，抵抗力变弱；还会对人体多种系统造成影响，如骨髓造血系统，使红细胞和血小板等的数量增多，抑制白细胞抗炎的功能，使消化系统紊乱，如诱发胃溃疡9等。人体长期每天使用超过 30 mg 的糖皮质激素会造成依赖性；人体每天使用超过 10
10、0 mg 的糖皮质激素可导致严重副作用；如果每天的使用量为 250 mg或以上时，则仅能用药数日后就需停药。糖皮质激素的检测对于应对非法添加、违规使用和限用等问题有着重要意义。现有的糖皮质激素检测方法有很多种，广泛使用的有高效液相色谱法（High Perform Liquid Chromatography，HPLC）8、超高效液相色谱法-串联质谱（UltraPerformanceLiquidChromatography-tandemMassSpectrometry，UPLC-MS/MS）10等主流检测方法，也有采用微固相萃取11、免疫层析12和电化学分析13的方法，但这些方法存在仪器昂贵、设备
11、体积大不易携带、对操作人员的技术专业性要求过高、处理繁琐、检测周期长的缺陷，不适用于监管部门和生产企业现场大量样本快速检测的需求。拉曼光谱技术14是一种高精度、灵敏、快速和无损的分子检测手段，有着“指纹”图谱分辨能力。具有拉曼活性的物质有着对应的拉曼特征峰位，拉曼特征峰强度随浓度的变化有着高低的变化，可根据拉曼峰特征建立数学模型，快速鉴别物质种类和浓度。拉曼光谱是一种强有力的物质分析手段。拉曼光谱在糖皮质激素检测上有着广泛的应用，如 Li 等人15应用薄层色谱结合斑点拉曼散射法建立了一种同时快速检测膳食补充剂中非法添加的 6 种糖皮质激素的方法。修梓侨等人16通过激光拉曼光谱分析了地塞米松的内
12、部结构和拉曼光谱关系，可快速准确地检测出地塞米松。本研究搭建了一种小型化的拉曼光路，采用532 nm 激光器对糖皮质激素地塞米松和氢化可的松固体样本和不同浓度的二甲基亚砜溶液进行了拉曼光谱测试，探讨应用拉曼光谱实现糖皮质激素定量检测的关键技术，针对多种预处理及回归方法进行分析比较，得出了一种可以在实验中快速进行拉曼检测的方法。本方法实现了准确测定糖皮质激素的浓度，为糖皮质激素的精准分析提供方案策略。1实验部分1.1仪器与试剂激发光源（MSL-FN-532，532 nm，新产业），保护银反射镜（RSR20-D254，锐纳光学），分光棱镜（CCM1-BS013/M，thorlabs），平场无限远消
13、色差显微物镜（20 倍，永新光学），滤光片（537 nm，OD6+，新产业），聚焦透镜（GCL-010601，大恒光电，f=200 mm），角度反射探头（海洋光学），光谱仪（sunshine 系列，探测范围：530720 nm，共1 958 个数据点，新产业），分析天平（UW620H，岛津制造所），石英比色皿（3.5 mL，两光通）。地塞米松（分析纯，麦克林），氢化可的松（分析纯，麦克林），二甲基亚砜（分析纯，福晨化学），无水乙醇（分析纯，富宇试剂），样品试剂皆为分析纯。本实验使用的所有玻璃仪器均经过超纯水清洗，实验使用水均为 Milli-Q 纯化的超纯水（18.2 Mcm）。1.2实验光路本
14、文采用显微拉曼测试系统，激发光源波长采用 532 nm。如图 1 所示，激光器发出的激光经范宇华，等：拉曼光谱检测糖皮质激素的方法研究第2期47长春理工大学学报（自然科学版）2023年过可调节衰减器，调节输出光功率同时输出线偏振光，线偏振光经四分之一波片后变为圆偏振光，经折转光路调节出光高度，后由分光棱镜分光，一束经过显微物镜将光斑聚集到装有被测样品的石英比色皿中，被激发的拉曼散射光由显微物镜收集回来，再经 537 nm 长波通滤光片将瑞利散射光强衰减至和拉曼散射光强度在同一数量级上，通过滤光片的拉曼散射光经聚焦透镜后聚焦，由光纤探头将拉曼散射信号传输至光谱仪。图 1拉曼光谱采集原理框图图 2
15、 所示为自行搭建的拉曼光谱采集实验平台。图 2拉曼光谱采集实验平台1.3样品制备糖皮质激素标准溶液配制：分别制备地塞米松与氢化可的松二甲基亚砜溶液 10 mgmL-1、20 mgmL-1、30 mgmL-1、40 mgmL-1、50 mgmL-1、60 mgmL-1、70 mgmL-1、80 mgmL-1、90 mgmL-1、100 mgmL-1共 10 个浓度梯度的标准液。分别制备 1 mgmL-1地塞米松与氢化可的松无水乙醇溶液。1.4拉曼光谱仪的校正及拉曼光谱采集拉曼光谱仪的校正及光谱采集工作在SpectralAnalysis 软件下完成。为保证拉曼光谱测量的准确性，需进行拉曼光谱仪的校
16、正，对激光波长进行校准：在拉曼频移为零位置处进行校正，即在拉曼测试之前，不放样品，拿掉537 nm长波通滤光片，用光谱仪测量激光器激发波长为 533.206 nm，在“Spectral Analysis”软件进行激发波长参数设定时输入 533.206 nm，之后测得在拉曼频移为零位置处的强度最大，则该波长为当前激光器激发波长校准值，安装滤光片后输入该波长重新进行暗光谱采集，此时完成激光波长校准工作17。运用“Spectral Analysis”软件完成数据采集及参数设定工作，积分时间 10 s，开始采集拉曼光谱之前，关闭激光器，避免环境光等对测试结果的影响，保存并扣除暗光谱，激发功率约200 mW，样品置于石英比色皿中，每个标准溶液取 20 个采样点，每点采 5 次取平均；采集地塞米松与氢化可的松固体粉末的拉曼光谱；采集地塞米松与氢化可的松无水乙醇溶液拉曼光谱；采集地塞米松与氢化可的松二甲基亚砜溶液拉曼光谱。1.5模型的建立及评价为提高信噪比，对比了基于不同参数的移动窗 口 平 均 法（Moving Window Averaging，MWA）、移 动 窗 口 中 位 值 法（Movin
