1、书书书第 卷 第 期东北林业大学学报 年 月 ）国家重点研发计划课题（）；国家自然科学基金项目（、）；国家级大学生创新创业训练计划（）。第一作者简介：张霄，女，年 月生，内蒙古农业大学草原与资源环境学院，硕士研究生。：。通信作者：冯超，内蒙古农业大学草原与资源环境学院，副教授。：。收稿日期：年 月 日。责任编辑：张玉。种典型旱生藓类的组织培养）张霄于雯馨薛宇博胡丁丁冯超（内蒙古农业大学，呼和浩特，）摘要以内蒙古草原区的优势类群 种苔藓为样本（角齿藓（）、丛生真藓（）、葫芦藓（）、赤藓（）、绢藓（）、紫萼藓（）、垂枝藓（），对苔藓样品进行不同的破碎处理后，采用整株、高打碎、低打碎 种不同接种方式
2、及 种不同 梯度（、）的诺普（）培养基进行组织培养，观察苔藓样品生长周期、破碎程度的生长方式及 种 梯度对苔藓样品生长的影响；采用原子吸收光度计、流动分析仪测定培养基中剩余的元素量，分析苔藓对金属元素（、）和非金属（、）吸收程度及苔藓样品生长所需营养成分；探索苔藓物种的快速繁殖方法。结果表明：破碎处理对不同苔藓植物的生长产生不同的影响；整株与低打碎处理样本的生长率高于高打碎处理的苔藓样本。不同 环境影响其破碎程度的生长率，为 时，高破碎程度的苔藓整体生长率显著高于低破碎程度的苔藓生长率；为 时，整株程度的苔藓整体生长率，显著低于高破碎程度苔藓生长率程度苔藓生长率。赤藓、丛生真藓、紫萼藓、垂枝藓
3、在高破碎处理时成功生长的株数，分别占其破碎程度株数的 、，高于整株及低打碎处理，适用于高破碎方式繁殖；葫芦藓、绢藓在低破碎处理时成功生长的株数，分别占其破碎程度株数的 、，高于整株及高打碎处理，适用于低破碎繁殖方式。对苔藓原丝体及茎叶体的生长量和发育时间有显著影响。高 对紫萼藓生长有明显促进作用，而对丛生真藓、赤藓有明显抑制作用；与 为 、为 相比，为 的培养基能够使角齿藓、赤藓、葫芦藓、绢藓、垂枝藓的增长速度较为稳定；为 培养基的苔藓原丝体出现的时间较短，大幅度缩短了其发育为原丝体的时间。不同苔藓对元素吸收程度有差异。角齿藓对钾吸收量最高，吸收了对照组平均值的 ；苔藓形态大小与其吸收钾量不成
4、正比。绢藓对钙吸收量较大，平均吸收了对照组平均值的 ，但 种苔藓对钙吸收量差异不显著。在诺普培养基的离子质量范围内，种苔藓对镁、锌吸收了对照组平均值的 。绢藓对磷吸收量最大（平均仅剩余 ），角齿藓对磷平均吸收量相较于其它苔藓最小（剩余 ）；除紫萼藓、角齿藓、绢藓以外，每个苔藓对磷吸收量差异不显著。绢藓对硝态氮吸收量最大（平均仅剩余 ），而角齿藓对硝态氮平均吸收量相较于其它苔藓最小（平均剩余 ）；大型、中型藓种（如垂枝藓、绢藓、赤藓）对硝态氮吸收量较高，而小型藓种对硝态氮吸收相对较少。垂枝藓对硫吸收量最大（平均仅剩余 ），而葫芦藓对硫平均吸收量相较于其它苔藓最小（平均剩余 ）；不同种类苔藓对硫吸
5、收量差异显著（）。关键词苔藓；组织培养；苔藓繁殖；苔藓人工培养分类号 ；，（，），（）：（），（），（），（），（，），（，）（，）：（）；，（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）（），（）（），（）（），（），（）（）（），（）（）（），（），（），（）（），（）（）；内蒙古地处干旱、半干旱气候带，具有气候酷寒、干旱缺水、沙化严重等特点，导致植被生长困难，生态环境十分脆弱 。当前的植被恢复困难，适宜北方草原退化生境予以修复的乡土物种稀缺，现有措施效果局限，需要寻找适宜的物种及其他植被恢复方法。苔藓植物作为先锋物种，在环境污染监测方面存在巨大的价值与潜力 ，在防止雨滴
6、对土壤的影响、保护表土、延缓地表径流侵蚀、构建抗侵蚀土壤结构等方面具有重要作用 。但是，旱生苔藓自然分布较少，非常容易受到地面表面的干扰，而且其结皮层从干扰中自然恢复需要的时间较长 ，严重限制了其在水土保持等领域的应用。魏志颖等 研究表明，蔗糖对于山墙藓原丝体的形成和扩展生长均具促进作用，质量浓度为 时原丝体形成时间最早、扩展直径最大，但抑制了芽体的分化，质量浓度为 时对芽体分化具明显促进作用。李育中等 使用液体培养基对双色真藓进行悬浮培养，并进行了孢子培养与愈伤组织的诱导。使用液体培养基建立泥碳藓培养体系，并发现线状原丝会随着片状原丝体增加而减少。因此，快速人工栽培对于加速在恶劣环境下苔藓结
7、皮层的恢复具有重要的现实意义。研究表明，霍格兰（）培养基对沙漠苔藓地壳的生长有促进作用。关于苔藓组织培养，已经探索出影响苔藓繁殖的多个因素，如水分、光照、培养基种类及激素使用等因素，都与苔藓的繁殖方式与速度存在关联，但其在不同破碎程度时苔藓的生长周期及其对培养基中元素的吸收程度，研究的较少。为此，本研究在对内蒙古草原分布调查的基础上，选定角齿藓（）、丛 生 真 藓（）、葫芦藓（）、赤藓（）、绢藓（）、紫 萼 藓（）、垂 枝 藓（）这些类群作为培养对象，通过整株、高打碎、低打碎 种不同接种方式以及 种不同 梯度（、）的诺普（）培养基进行组织培养；观察苔藓样品生长周期、破碎程度的生长方式及 种 梯
8、度对苔藓样品生长的影响，分析苔藓对金属元素（、）和非金属（、）吸收程度及苔藓样品生长所需营养成分，探索苔藓物种的快速繁殖方法；旨在为内蒙古草原旱生藓类的大规模繁殖提供参考。材料与方法 试验用苔藓类群遴选及来源在自然环境中，旱生藓类由于其生长缓慢，严重制约其生态功能的应用，而旱生藓类大面积繁殖还处于空白，特别是培养中最关键的繁殖方式和元素吸收的研究较少。本研究在前期对内蒙古草原分布调查的基础上，最终选定角齿藓、丛生真藓、葫芦藓、赤藓、绢藓、紫萼藓、垂枝藓这些类群作为培养对象。角齿藓、丛生真藓、葫芦藓 收集于中国内蒙古自治区锡林郭勒盟胜利矿区（地理坐标：北纬 、东经 ）；该地年平均气温 ，年平均降
9、水量 ，年平均风速 ，土壤类型为风沙土质。赤藓 收集于中国内蒙古自治区锡林郭勒浑东北林业大学学报第 卷善达克沙地（地理坐标：北纬 、东经 ）；该地年平均气温 ，年平均降水量东部为 、西部为 ，年平均风速 ，土壤类型为风沙土和栗钙土。绢藓、紫萼藓 收集于中国内蒙古自治区呼和浩特市大青山环境保护区（地理坐标：北纬 、东经 ）；该地年平均气温 ，年平均降水量 ，年平均风速 ，土壤类型为栗钙土质。垂枝藓 收集于中国内蒙古自治区呼伦贝尔市（地理坐标：北纬 、东经 ）；该地年平均气温 ，年平均降水量 ，年平均风速 ，土壤类型为黑土、暗棕壤、黑钙土、草甸土质。在其相应生境内，选取生长良好且发育一致的苔藓群落
10、，随机选取 个样点，使用铲子分别采取赤藓、角齿藓、丛生真藓、葫芦藓、绢藓、垂枝藓、紫萼藓，取得样品 份，封存后运回实验室备用。组织培养苔藓的培养基的配制本研究试验选取诺普（）液体培养基进行组织培养试验。培养基成分：硝酸钙（）为 、硝酸钾（）为 、磷酸二氢钾（）为 、硫酸镁（）为 、硫酸锌（）为 、蒸馏水为 。苔藓植株的破碎处理及组织培养苔藓的接种与培养将诺普培养基倒入 个 锥形瓶中，使用盐酸和氢氧化钠溶液调节 为 、。将其均分于 个 的三角瓶中并用封口膜包裹；使用高压蒸汽灭菌锅将实验工具进行灭菌。后，取出工具置于超净台内，同时打开超净工作台的紫外射线灯与通风装置，对培养工具及超净工作台进行 的
11、消毒工作。将植株放入蒸馏水中浸泡至植物体完全舒展，将其依次放置在解剖镜下观察，并使用蒸馏水冲洗苔藓表面的泥土、沙粒等杂质。重复以上步骤，直至无明显杂质且保留其完整假根。本试验采取 种植株处理方式，即高破碎处理、低破碎处理、整株。高打碎处理，即使用美国 快速组织细胞破碎仪 档，运行 ，将苔藓植株进行破碎处理为平均长度 的小段；低打碎处理，即使用刀片，将苔藓植物切为其长度 的小段。在超净工作台内使用体积分数为 的酒精浸泡 ，然后放入无菌水漂洗并用滤纸吸干；重复以上步骤 次。将各处理以此接种到诺普培养基上，每个培养基接种 株苔藓，并设置 个重复。接种完毕，将苔藓放置于布鲁帕德（）培养箱中（培养温度
12、，光照强度 ，光照光照 、黑暗 ），培养 。诺普培养基包括 种金属元素（、）、种非金属元素（、）。组织培养苔藓培养基消毒时间及消毒剂的筛选苔藓组织培养的相关研究，主要集中在培养基成分选择、消毒方式、组培条件筛选等方面。选择体积分数为 的无水乙醇、质量分数为 的次氯酸钠溶液作为消毒试剂，设计 个消毒方案（乙醇 次氯酸钠、乙醇 次氯酸钠、乙醇 次氯酸钠、乙醇 次氯酸钠、乙醇 次氯酸钠、乙醇 次氯酸钠、乙醇 次氯酸钠、乙醇 次氯酸钠），将苔藓外植体做以上梯度处理后接种到诺普培养基上。后，通过观察其外植体的状态、成活率以及染菌情况，不同苔藓植物适应的消毒时间与消毒液种类存在差异，通过梯度试验最终确定“
13、乙醇 次氯酸钠”为多数外植体消毒的最佳方案。苔藓培养基剩余元素的测定培养 后，选择 为 的培养基，取出外植体、原丝体后，将剩余培养液使用无磷滤纸过滤 次，直至无明显杂质；使用原子吸收光度计 火焰法测定 、元素，使用流动分析仪测量 元素；使用硫酸钡比浊法测定 元素，使用钼锶胺比色法测定 元素。标准曲线的制定：采取原子吸收光度计 火焰法对其进行检测，取 钙元素标准溶液（）置于 容量瓶中，得到质量浓度为 的钙使用液；再分别吸取 、钙标准液加入 的容量瓶，并定容至刻度线，最终得到质量浓度为 、的标准液。用同样方法绘制钾、镁、锌元素标准曲线。样品处理：标准溶液配制完毕后，将仪器置于工作状态，开始空烧；待
14、仪器基线稳定后，调节基线和增益；待基线稳定后，进行标准曲线各质量浓度点的测定；标准曲线测定完毕后，开始测量待测样品。设置空白对照组 个重复，将配好的空白诺普培养基与其它样本在相同条件环境放置 。后，取出培养的 为 的苔藓样本及其原丝体，使用 无磷滤纸将液体培养基过滤 次，直至无杂质，使用原子吸收光度计 火焰法进行测定。依据测定结果，分析不同苔藓对于元素的吸收程度；测定剩余元素越多，说明此种苔藓样本对于该元素的吸收量相对越少。第 期张霄，等：种典型旱生藓类的组织培养 数据处理试验设置 次重复，数据均采用 统计软件中的单因素方差分析、多因素方差分析方法，比较其差异性。结果与分析 不同破碎处理对苔藓
15、植物生长的影响不同植株的破碎处理，对苔藓植物的生长产生影响。根据观测统计（见表 ），整株与低打碎处理样本的生长率，高于高打碎处理的苔藓样本。不同的 环境影响其破碎程度的生长率，在 为 的培养环境时，高破碎程度的苔藓整体生长率，显著高于整株、低破碎程度苔藓生长率；在 为 的培养环境时，整株程度的苔藓整体生长率，显著低于高破碎程度苔藓生长率。赤藓、丛生真藓、紫萼藓、垂枝藓高破碎处理成功生长的株数，分别占其破碎程度株数的 、，高于整株、低打碎处理，表明其适用于高破碎方式繁殖。葫芦藓，绢藓的低破碎处理成功生长的株数，分别占其破碎程度株数的 、，高于整株、高打碎处理，表明其适用于低破碎的繁殖方式。部分苔
16、藓植物，高破碎后更倾向于产生大量的原丝体，而低打碎植株更倾向于产生大量的茎叶体，最终发展成完整的植株。表 不同破碎处理的苔藓植物在不同 培养环境时的总体生长率破碎处理苔藓植物总体生长率 总体（破碎）整株 低打碎 高打碎 培养基 对苔藓植物生长的影响采取梯度试验，配剂 为 、的诺普培养基，将苔藓外植体接种于培养基中培养 期间观察记录其生长状况。由图 可见：在诺普培养基中，不同 对苔藓植物原丝体及茎叶体的生长量和发育时间产生显著的影响。高 对于紫萼藓的生长有明显的促进作用，而对丛生真藓、赤藓具有明显抑制作用。与 为 、为 相比，为 时的培养基能够使角齿藓、赤藓、葫芦藓、绢藓、垂枝藓的增长速度较为稳定。在培养 时，各个 培养环境的苔藓生长趋于平稳，达到最高峰值。经过 的观察记录发现，原丝体量随着茎叶体量升高而下降，推测减少的部分原丝体转化为茎叶体，从而继续生长。；。图 培养基 种 时不同苔藓的生长情况东北林业大学学报第 卷 金属元素对苔藓植物生长的影响随着培养试验的持续，苔藓培养基内钾离子质量浓度呈现下降的变化趋势。经过测量，空白对照组钾离子的平均剩余量为 。由表 可见：角齿藓对钾离子的吸收
