1、论著基础研究基金项目：河北省中医药类科研计划课题（）第一作者简介：郑文丽，硕士，主管中药师，研究方向：中药制剂。通信作者简介：位庚，博士，主治医师，研究方向：中西医结合临床专业。津力达联合通心络通过 信号通路对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的干预作用郑文丽 魏艳婷 位 庚（石家庄市第二医院药剂科、河北省糖尿病基础医学研究重点实验室、石家庄市糖尿病精准诊疗技术创新中心，河北省石家庄市；石家庄市第四医院药剂科，河北省石家庄市）【摘要】目的 探讨津力达联合通心络通过核因子 相关因子（）血红素氧合酶（）信号通路对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞（）损伤的干预作用。方法将 分成正常对照组、模型组、津力达组、通
2、心络组、联合用药组，正常对照组细胞采用含 葡萄糖的 培养，模型组、津力达组、通心络组、联合用药组细胞采用含 葡萄糖的 培养，津力达组加入 的津力达贮存液，通心络组加入 的通心络贮存液，联合用药组加入 的津力达贮存液和 的通心络贮存液。采用 法检测各组细胞活力，采用克隆形成实验检测各组细胞的克隆形成数量，采用 检测细胞侵袭能力，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，采用划痕实验检测各组细胞迁移率，采用 检测各组细胞的炎症因子水平，检测各组细胞的氧化应激相关指标水平，采用 检测各组细胞的、蛋白表达量。结果 与正常对照组相比，模型组细胞的活力、克隆形成数量、侵袭细胞数量、细胞迁移率均降低，细胞凋亡率升高
3、，细胞间黏附分子（）、肿瘤坏死因子（）、白细胞介素（）、丙二醛、乳酸脱氢酶（）水平均升高，超氧化物歧化酶（）、一氧化氮、一氧化氮合成酶（）水平及、蛋白表达量均降低（均 ）；与模型组相比，津力达组、通心络组和联合用药组细胞的活力、克隆形成数量、侵袭细胞数量、细胞迁移率均升高，细胞凋亡率均降低，、丙二醛、水平均降低，、一氧化氮、水平及、蛋白表达量均升高，且联合用药组上述指标均优于津力达组和通心络组（均 ）。结论 津力达和通心络均通过抑制炎症反应和氧化应激反应来减轻高糖所致的 损伤，且联合用药效果更好，其机制可能与激活 信号通路有关。【关键词】人脐静脉内皮细胞；高糖损伤；津力达；通心络；核因子 相关
4、因子；血红素氧合酶；炎症因子；氧化应激【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】（）：，（，；，）【】（）（）（），广西医学 年 月第 卷第 期 ，（），（），（），（），（），（），（），；，（），【】，糖尿病是由环境和遗传因素相互作用导致胰岛素分泌相对或绝对不足，或者组织细胞对胰岛素敏感性相对降低，而引起的脂肪、糖、蛋白和电解质等一系列代谢紊乱。糖尿病可引起一系列微血管和大血管并发症，例如糖尿病肾病、视网膜病变、神经病变和心脑血管疾病等，严重影响患者的生活质量。研究表明，糖尿病是我国继心脑血管疾病和肿瘤疾病之后的第三大非传染性慢性疾病，严重威胁着居民健康。有学者发现，炎症和氧化应激在糖尿病患
5、者的心血管病变的发病中起着至关重要的作用，高血糖引发的蛋白激酶 激活、细胞内糖基化终产物增加等都与线粒体产生过多的活性氧簇相关，并最终导致氧化应激。目前糖尿病主要以药物治疗为主，新药的研发和应用对于疾病的治疗具有重要意义。本研究观察津力达联合通心络通过核因子 相关因子（，）血红素氧合酶（，）信号通路抑制高糖诱导损伤的人脐静脉内皮细胞（，）的炎症和氧化应激反应，现报告如下。材料与方法 主要药物、试剂和仪器 购自中国科学院上海细胞库。津力达干粉、通心络超微粉购自石家庄以岭药业股份有限公司（批号：、）；、胎牛血清、青霉素链霉素双抗均购自宝生物工程（大连）有限公司（批号：、）；试剂盒、细胞凋亡检测试剂
6、盒购自上海碧云天生物技术有限公司；、一抗均购自 公司（批号：、）；丙二醛、超氧化物歧化酶（，）、一氧化氮合酶（，）、一氧化氮检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所（批号：、）；葡萄糖培养基、结合缓冲液、乳酸脱氢酶（，）、细胞裂解液均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；细胞间黏附分子（，）、肿瘤坏死因子（，）、白细胞介素（，）、，检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所（批号：、）；流式细胞仪购自，；酶标仪购自 公司。实验方法 细胞培养：采用含 胎牛血清的，并置于、相对湿度为 的培养箱中进行培养，根据细胞的生长贴壁情况约每 更换培养基一次，待细胞生长至融合度为 时进行传代培养。药物配置和细胞分组
7、干预：取津力达干粉 和通心络超微粉 ，分别溶于 含 胎牛血清、青霉素链霉素双抗的，使用超声波震动 促进药物溶解，然后在 下以 离心 ，将获得的沉淀物采用 的羧甲基纤维素钠微孔滤器过滤，将所有沉淀物加热烘干，配制成 的津力达贮存液和 的通心络贮存液。将处于对数生长期的 分成正常对照组、模型组、津力达组、通心络组、联合用药组，正常对照组细胞采用含 葡萄糖的 培养；模型组、津力达组、通心络组、联合用药组细胞均采用含 葡萄糖的 培养，在此基础上，津力达组加入 的津力达贮存液，通心络组加入 的通心络贮存液，联合用药组加入 的津力达贮存液和 的通心络贮存液。各组细胞均培养 后进行后续实验。法检测细胞活力：
8、将处于对数生长期的 以 个 孔的密度接种于 孔板，按 的方法对细胞进行分组并干预 后，继续培养 ，弃掉各组 原有培养基，每孔加入 的 工作液，室温孵育 ，采用酶标仪检测 波长处的吸光度值。按照公式计算细胞活力，细胞活力 （实验组吸光度值 空白对照吸光度值）（正常对照组吸光度值 空白对照吸光度值），其中空白对照为仅加入培养液的空白培养孔。实验重复 次。克隆形成实验检测细胞克隆形成能力：将处于对数生长期的 以 个 孔接种于 孔板，按 的方法对细胞进行分组并干预 后，将 的琼脂与 以 的比例混匀，加入细胞中，再将细胞培养板放入 、培养箱内培养 周，肉眼可观察到克隆形成时终止培养，采用 洗涤 次，次，
9、采用 的甲醇固定，结晶紫染色，自来水冲洗晾干后于显微镜（）下拍照计数。克隆形成率 （克隆数 接种细胞数）。实验重复 次。检测细胞侵袭能力：（）小室的准备。取出冻存于 的基质胶，溶解后过夜。将溶解后的基质胶与无血清的 培养基按照 混合后，取 混合液加入 小室的上室内，将 小室置于培养箱孵育 后取出，于 小室的下室加入 无血清的 培养基，于上室内加 无血清的 培养基，孵育 。（）实验。将处于对数生长期的 以 个 接种于 孔板，按 的方法对细胞进行分组并干预 后，弃上清液，加入无血清的 培养基，置于 、培养箱培养 后，收集细胞，制备单细胞悬液，下以 离心，弃上清液，调整细胞密度为 个，将 单细胞悬液
10、加入 上室，将调整密度后的细胞加入下室，加入含 胎牛血清的 培养基 ，将 小室置于、培养箱中培养 后，用棉签拭去膜上的细胞后，在小室中添加甲醛溶液固定细胞，使用 结晶紫溶液染色，显微镜（）下记录 个视野的细胞数，取 个视野的平均值。实验重复 次。划痕实验检测细胞迁移能力：将处于对数生长期的 以 个 孔接种于 孔板，采用 枪头在孔板底部垂直画线，按 的方法对细胞进行分组并干预 后，采用 冲洗 次，次，在倒置显微镜下拍照记录 和 的细胞迁移情况，计算 的迁移率，细胞迁移率 迁移面积 划痕面积。实验重复 次。流式细胞仪检测细胞凋亡情况：将处于对数生长期的 以 个 孔接种于 孔板，按的方法对细胞进行分
11、组并干预 后，加入 结合缓冲液，再分别加入 染色液，混匀后避光反应 ，另加入 结合缓冲液混匀，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率，细胞凋亡率 凋亡细胞数（凋亡细胞数 正常细胞数）。实验重复 次。检测炎症因子水平：将处于对数生长期的 以 个 孔接种于 孔板，按 的方法对细胞进行分组并干预 后，收集各组，下以 离心，收集上清液，严格按照 检测试剂盒说明书进行操作，检测 、和 水平，实验重复 次。氧化应激相关指标的检测：将处于对数生长期的 以 个 孔接种于 孔板，按 的广西医学 年 月第 卷第 期方法对细胞进行分组并干预 后，收集上清液，采用硫代巴比妥酸显色法检测丙二醛水平，用黄嘌呤氧化酶法测定 水平，用
12、重叠比色法检测 水平，用硝酸还原酶法检测一氧化氮水平，用比色法检测 水平，检测方法严格参照各试剂盒产品说明书进行操作。实验重复 次。检测、蛋白表达量：将处于对数生长期的 以 个 孔接种于 孔板，按 的方法对细胞进行分组并干预 后，收集各组，采用 细胞裂解液裂解细胞，提取各组细胞的总蛋白，采用二喹啉甲酸法进行蛋白定量。取 蛋白进行，然后将蛋白转移到 膜上，采用 的脱脂奶粉封闭液在室温下封闭 膜 ，加入 一抗（以 比例稀释）、一抗（以 比例稀释）和 一抗（以 比例稀释），摇床孵育过夜后加入 荧光二抗（公司，批号：；以 比例稀释），室温孵育 后采用 红外荧光成像仪扫描成像，以目的蛋白（、）条带的灰度
13、值 内参蛋白（）条带的灰度值作为目的蛋白的相对表达量。实验重复 次。统计学分析 采用 软件进行统计分析。计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用 检验。以 为差异有统计学意义。结 果 组 活力的比较与正常对照组相比，模型组细胞活力降低（）；与模型组比较，津力达组、通心络组和联合用药组细胞活力均升高，且联合用药组细胞活力均高于津力达组和通心络组（均 ），而津力达组和通心络组细胞活力差异无统计学意义（）。见表。表 组 活力、克隆形成能力、侵袭能力的比较（）组别细胞活力（）克隆形成数量（个 视野）侵袭细胞数量（个 视野）正常对照组 模型组 津力达组 通心络组 联合用药组
14、值 值 注：与模型组比较，；与联合用药组比较，。组 克隆形成能力的比较 与正常对照组相比，模型组细胞的克隆形成数量减少（）；与模型组比较，津力达组、通心络组和联合用药组细胞的克隆形成数量均增加，且联合用药组细胞的克隆形成数量均多于津力达组和通心络组（均 ），而津力达组和通心络组细胞的克隆形成数量差异无统计学意义（）。见表、图。图 组 克隆形成情况（）组 侵袭能力的比较 与正常对照组相比，模型组的侵袭细胞数量减少（）；与模型组比较，津力达组、通心络组和联合用药组的侵袭细胞数量均增加，且联合用药组中的侵袭细胞数量均多于津力达组和通心络组（均 ），而津力达组和通心络组的侵袭细胞数量差异无统计学意义（
15、）。见表、图。，图 组 的侵袭能力 组 迁移能力的比较 与正常对照组相比，模型组的细胞迁移率降低（）；与模型组比较，津力达组、通心络组和联合用药组的细胞迁移率均升高，且联合用药组的细胞迁移率均高于津力达组和通心络组（均 ），而津力达组和通心络组的细胞迁移率差异无统计学意义（）。见表、图。表 组细胞迁移率、细胞凋亡率的比较（，）组别细胞迁移率细胞凋亡率正常对照组 模型组 津力达组 通心络组 联合用药组 值 值 注：与模型组比较，；与联合用药组比较，。图 组 的迁移能力 组 凋亡情况的比较 与正常对照组相比，模型组的细胞凋亡率升高（）；与模型组比较，津力达组、通心络组和联合用药组的细胞凋亡率均降低
16、，且联合用药组的细胞凋亡率均低于津力达组和通心络组（均 ），而津力达组和通心络组的细胞凋亡率差异无统计学意义（）。见表、图。图 组 的凋亡率检测结果 组 炎症因子水平的比较 与正常对照组相比，模型组细胞的、水平均升高（均 ）；与模型组比较，津力达组、通心络组和联合用药组细胞的、水平均降低，且联合用药组细胞的、水平均低于津力达组和通心络组（均 ），而津力达组和通心络组细胞的、水平差异均无统计学意义（均 ）。见表。广西医学 年 月第 卷第 期表 组细胞炎症因子水平的比较（）组别（）（）（）（）正常对照组 模型组 津力达组 通心络组 联合用药组 值 值 注：与模型组比较，；与联合用药组比较，。组 氧化应激相关指标水平的比较 与正常对照组相比，模型组细胞的丙二醛、水平均升高，、一氧化氮、水平均降低（均 ）；与模型组比较，津力达组、通心络组和联合用药组细胞的丙二醛、水平均降低，、一氧化氮、水平均升高（均 ），且联合用药组细胞的丙二醛、水平均低于津力达组和通心络组，、一氧化氮、水平均高于津力达组和通心络组（均 ），而津力达组和通心络组上述指标差异均无统计学意义（均 ）。见表。表 组细胞氧化应激相关
