1、 19 工艺技术 食品工业 2023 年第44卷第 2 期响应面优化山楂叶总黄酮的提取工艺及体外降脂研究牛成伟*，宋涵瑶，顾浩，李长春，雷小婷江苏食品药品职业技术学院药学院（淮安 223001）摘要以山楂叶为研究对象,研究其总黄酮提取工艺及降脂活性。在单因素试验基础上,采用Box-Behnken响应面法对山楂叶总黄酮的提取工艺进行优化,考察乙醇体积分数、液料比和提取时间对其总黄酮产率的影响,以胰脂肪酶抑制率为指标评价山楂叶总黄酮的降脂活性。结果表明,最佳提取条件为乙醇体积分数56%、液料比281(mL/g)、提取时间34 min,此时山楂叶总黄酮产率为4.43%。活性测定结果表明,山楂叶总黄酮
2、具有较好的降脂活性,且具有一定的浓度依赖性。优选的山楂叶总黄酮提取工艺方法可行,其总黄酮具有一定降脂活性。关键词山楂叶;响应面;总黄酮;提取;降脂Optimization for the Extraction Process of the Flavonoids from the Hawthorn Leaves by Response Surface Methodology and Evaluation of Hypolipidemic ActivityNIU Chengwei*,SONG Hanyao,GU Hao,LI Changchun,LEI Xiaoting Pharmacy Coll
3、ege of Jiangsu Food and Pharmaceutical Science College(Huaian 223001)Abstract Optimize the extraction process and evaluate hypolipidemic effects of total flavonoids in the hawthorn leaves.Based on a single factor test,the ethanol concentration,the ratio of solvent to material and the extraction time
4、 were used as the factors,and the Box-Behnken was used to design the extraction process.The inhibition rate of pancreatic lipase was used to assess the hypolipidemic effect of total flavonoids in the hawthorn leaves.The result showed that the optimal extraction condition was as follows:ethanol conce
5、ntration,the ratio of solvent to material and extraction time were 56%,281(mL/g),and 34 min,respectively.Under the above condition,the experimental yield of total flavonoids in the hawthorn leaves was 4.43%.Furthermore,total flavonoids in the hawthorn leaves exhibited significant hypolipidemic effec
6、ts in vitro in a dose-dependent manner.The optimum extraction process of the flavonoids from the hawthorn leaves is feasible,and total flavonoids in the hawthorn leaves have significant hypolipidemic effects.Keywords hawthorn leaves;response surface methodology;total flavonoids;extraction;hypolipide
7、mic effect*通信作者；基金项目：江苏省大学生创新创业训练计划（202113104038Y），江苏食品药品职业技术学院横向课题（jssp2020210），江苏食品药品职业技术学院博士科研启动基金（993011401575）黄芩是唇形科植物黄芩的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。山楂（Crataegus pinnatifida Bunge），又名红果、山里红等，为蔷薇科山楂属落叶乔木，全球有250余种，在中国种植资源丰富1。山楂味甘酸，具有消食行健、行气化瘀的功效，临床主要用来治疗食物积滞、腹痛泻痢、胸痛腹痛、痛经、吐血、便血等2-3。现代药理学研究表明，山楂具有抗氧化、
8、降血脂、助消化等生物活性4-6。在化学成分方面，它含有黄酮类、三萜类、氨基酸等多种成分7。随着社会的发展，保健安全越来越受到重视，因此研究和开发植物中的天然活性成分成为热点。而黄酮类成分作为植物中天然成分的一种，具有较高的营养价值和生理保健功能，因而也备受关注。作为药食同源植物，山楂中含有大量的黄酮类成分。临床主要使用其果实，而叶往往被丢弃，造成资源的浪费。因此，选择山楂叶作为研究对象。已有研究设计了多种从植物中提取黄酮类物质的方法。传统方法有乙醇浸提8，新型提取方法有酶法提取9、超临界萃取10、超声波辅助提取11。其中，超声波辅助提取法具有操作简单、提取工时少、提取效率高等优点。因此，试验采
9、用简单易行的超声波辅助提取法提取山楂叶中总黄酮，通过单因素试验及响应面试验研究其最佳提取工艺，并进一步测定其降脂活性，对提高山楂资源的综合利用具有重要意义。1材料与方法1.1药物与试剂山楂叶，采于江苏淮安，经江苏食品药品职业技术学院祝冬青副教授鉴定为蔷薇科植物山楂Crataegus pinnatifida Bunge的干燥叶。芦丁（分析标准品，南京广润生物科技有限公司）；乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；月桂酸4-硝基苯酯、猪胰食品工业 2023 年第44卷第 2 期 20 工艺技术脂肪酶（生物试剂，阿拉丁生化科技有限公司）。1.2仪器与设备T6型紫外可见分光光度
10、计（北京普析通用仪器有限责任公司）；HH-W420恒温水浴锅（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）；ME203E分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；SY5200-D超声仪（上海声源超声波仪器设备有限公司）。1.3试验方法1.3.1山楂叶总黄酮得率的测定采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法12检测提取液中总黄酮含量，绘制得总黄酮质量浓度（Y，mg/mL）与吸光度（X）标准曲线：Y=0.250 5X-0.010 1，R2=0.997 4，按照标准曲线公式（式1）计算总黄酮得率。Y=CVN100%/W （1）式中：Y为超声波提取总黄酮得率，%；C为由标曲计算所得总黄酮质量浓度，mg/mL；V为提取液体
11、积，mL；N为稀释倍数；W为提取用山楂叶的质量，mg。1.3.2单因素试验1.3.2.1液料比的筛选取适量山楂叶，精密称定，分别加入60%乙醇溶液，使60%乙醇溶液与山楂叶粉末液料比为101，201，301，401和501（mL/g），超声提取30 min，研究不同液料比对山楂叶总黄酮得率的影响。1.3.2.2乙醇体积分数的筛选取适量山楂叶，精密称定，按照液料比301（mL/g），分别加入40%，50%，60%，70%和80%的乙醇溶液，超声提取30 min，研究不同体积分数乙醇对山楂叶总黄酮得率的影响。1.3.2.3提取时间的筛选取适量山楂叶，精密称定，按照液料比301（mL/g），加入60
12、%乙醇溶液，分别超声提取15，30，45，60和75 min，研究不同提取时间对山楂叶总黄酮得率的影响。1.3.2.4响应面试验根据单因素试验结果，确定乙醇体积分数（A）、液料比（B）、提取时间（C）的水平范围，以山楂叶总黄酮得率（Y）为响应值，根据Box-Behnken设计原理，用Design-Expert 12.0安排试验。因素与水平表见表1。表1响应面因素与水平表水平因素A乙醇体积分数/%B液料比/(mLg-1)C提取时间/min-15020 12006030 13017040 1401.3.2.5体外降脂试验 取0.5 mL脂肪水解酶缓冲液（0.5 U/L），加入0.5 mL各样品溶液
13、（2.5，5.0，10.0，15.0和20.0 mg/mL）充分混匀后37 温浴 15 min，加入0.5 mL月桂酸4-硝基苯酯充分混匀后，37 下温浴15 min，于405 nm处测定吸光度。以不加酶组为空白组，以不加样品组为对照组。试验重复3次，按式（2）计算各样品对胰脂肪酶的抑制率。抑制率=1-（A1-A2）/A3100%（2）式中：A1为样品组的吸光度；A2为空白组吸光度；A3为对照组吸光度。2结果与分析2.1山楂叶总黄酮提取工艺的优化2.1.1乙醇体积分数的影响如图1所示，乙醇体积分数从20%增加到60%时，山楂叶总黄酮得率随着乙醇体积分数增加而逐渐升高。乙醇体积分数60%时，山楂
14、叶总黄酮得率呈现最大值。随着乙醇体积分数继续增大，山楂叶总黄酮得率降低。因此初步选择乙醇体积分数60%。这可能是基于相似相溶的原理，乙醇体积分数60%时，溶剂和山楂叶黄酮类化合物有相似的极性，因而黄酮类化合物溶出度最大。图1乙醇体积分数对山楂叶总黄酮得率的影响2.1.2液料比的影响图2液料比对山楂叶总黄酮得率的影响如图2所示，随着液料比增加，山楂叶总黄酮得率逐渐增加。增至301（mL/g）时，总黄酮得率达到最大值。液料比大于301（mL/g）时，山楂叶总黄酮得率下降，这可能是溶剂过量，导致传质速度降 21 工艺技术 食品工业 2023 年第44卷第 2 期低。因此，初步选择液料比301（mL/
15、g）。2.1.3提取时间的影响如图3所示，提取时间由15 min增加到45 min时，山楂叶总黄酮得率逐渐增加。然而，随着时间的延长，得率降低。可能是提取时间延长，黄酮类化合物溶解增加，进而提高山楂叶黄酮类化合物的溶出。然而，时间过长导致山楂叶黄酮类化合物的吸附，得率降低。因此，初步选择提取时间45 min。图3提取时间对山楂叶总黄酮得率的影响2.1.4响应面模型方差分析根据单因素试验结果，采用Box-Behnken试验，以乙醇体积分数（A）、液料比（B）和提取时间（C）为自变量，以山楂叶总黄酮得率为响应值，进行三因素三水平响应面优化试验，对山楂叶总黄酮提取工艺参数进行优化。具体试验方案及相应
16、结果见表2，方差分析见表3。表2响应面设计方案及结果序列A乙醇体积分数/%B液料比/(mLg-1)C提取时间/minY得率/%15030 1203.2426040 1203.883456789101112131415161750605070606060606060607070705030 130 140 130 130 120 120 140 130 130 130 140 130 120 120 14030302030204040303030304030304.433.444.113.564.214.413.674.383.923.664.273.674.263.723.55应用Design-Expert 12.0对试验结果分析，得到山楂总黄酮得率对乙醇体积分数、液料比、提取时间的二次多项回归方程式：Y=4.35-0.117 5A-0.080 0B+0.232 5C+0.022 5AB-0.137 5AC-0.062 5BC-0.208 8A2-0.343 8B2-0.393 7C2。式中：Y为山楂叶总黄酮得率（%），A为乙醇体积分数（%），B为液料比（mL/g），C为提取时间（mi
