1、中国国境卫生检疫杂志2023年2月第46卷第1期Chinese Frontier Health Quarantine Feb.2023，Vol 46，No.1Comparison and application of identification methods for false-positivePseudomonas aeruginosaZHANG Zhichao，WU Xin，ZHU Yingfei，LIU DeFood Inspection and Testing Institute of Jiangxi General Institute for Inspection，Testing
2、 and Certification，Nanchang，Jiangxi 330000，ChinaAbstract：ObjectiveTo investigate the detection accuracy of Pseudomonas aeruginosa in GB 8538-2016 NationalFood Safety Standard-Inspection Methodsfor Drinking Natural Mineral Water.MethodsAccording to GB 8538-2016，Pseudomonasaeruginosainonebarreleddrink
3、ingwatersamplewasdetected，andtheisolatedpositivebacteria ZH-1 and ZH-2 were confirmed by 16S rRNA gene sequencing，API 20E kit，VITEK2 identificationinstrument and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry（MALDI-TOF MS）.At thesame time，the applications of 42C growth
4、test，nitrate reduction gas production test，API 20E kit，VITEK2 qualifierand MALDI-TOF MS were compared.ResultsIt was confirmed by various methods that the strain ZH-1 wasPseudomonas aeruginosa.The strain ZH-2 was Pseudomonas malignant，a false-positive bacterium detected by GB8538-2016.In the 42C grow
5、th test and nitrate reduction gas production test，strain ZH-2 was negative，and 38strains of Pseudomonas aeruginosa from different sources were positive.In addition，the API 20E kit and VITEK2system had 92.1%and 97.4%accuracy for the identification of Pseudomonas aeruginosa，respectively，but the API20E
6、 kit had to be supplemented，which was time-consuming and cumbersome.The MALDI-TOF MS method wasable to identify Pseudomonas aeruginosa to the genus level，but the species level consistency accuracy was only 43.2%.ConclusionOn the basis of the identification method of national standard，the addition of
7、 42C growth test ornitrate reduction gas production test can exclude the interference of Pseudomonas aeruginosa false-positive bacteria.The VITEK2 system is more suitable for the detection of Pseudomonas aeruginosa than API 20E kit and MALDI-TOF MS.Keywords：Pseudomonas aeruginosa；Barreled drinking w
8、ater；False-positive；Growth test；Nitrate reduction gas productiontest卫生监督铜绿假单胞菌假阳性株的鉴定方法比较及应用章志超，吴鑫，朱应飞，刘德江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院，江西 南昌330000摘要：目的探讨提高GB 85382016食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法中铜绿假单胞菌的检测准确性。方法按照GB 85382016，检测1份桶装饮用水样品中铜绿假单胞菌，并用16S rRNA基因测序法、API 20E试剂盒、VITEK2鉴定仪、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对分离到的“阳
9、性菌”ZH-1和ZH-2进行确认。同时比较42生长试验、硝酸盐还原产气试验、API 20E试剂盒、VITEK2鉴定仪和MALDI-TOF MS的应用。结果经多种方法确证，菌株ZH-1为铜绿假单胞菌，菌株ZH-2为恶臭假单胞菌，是GB 85382016检出的假阳性菌。在42生长试验和硝酸盐还原产气试验中，菌株ZH-2为阴性反应，不同来源的38株铜绿假单胞菌则均为阳性。此外，API 20E试剂盒和VITEK2系统对铜绿假单胞菌鉴定准确率分别为92.1%、97.4%，但API 20E试剂盒必须进行补充试验，耗时、繁琐；MALDI-TOF MS能够将铜绿假单胞菌鉴定到属水平，但种水平一致性准确率仅为4
10、3.2%。结论在国家标准的鉴定方法基础上，增加42生长试验或硝酸盐还原产气试验能够排除铜绿假单胞菌假阳性菌干扰。采用VITEK2系统比API 20E试剂盒和MALDI-TOF MS更适用于铜绿假单胞菌的检测。关键词：铜绿假单胞菌；桶装饮用水；假阳性；生长试验；硝酸盐还原产气试验中图分类号：R183；TS207.4文献标识码：ADOI：10.16408/j.1004-9770.2023.01.011基金项目：国家市场监督管理总局科技计划项目（2021MK058）通信作者：章志超，E-mail：46中国国境卫生检疫杂志2023年2月第46卷第1期Chinese Frontier Health Qu
11、arantine Feb.2023，Vol 46，No.1铜绿假单胞菌是一种常见的条件致病菌，可引起肺炎、泌尿系统感染，甚至败血症1。近年来，我国桶装饮用水因水源污染、水桶消毒不当及加工过程交叉污染等原因造成铜绿假单胞菌超标严重2-3，这些问题占报道的包装饮用水质量不合格的大多数4，导致食品安全隐患，成为包装饮用水生产企业工艺控制的难题和市场监管的重点。包装饮用水中铜绿假单胞菌的最主要检验依据是GB 85382016食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法，一些研究报道了应用该标准方法在日常检验中存在假阳性或假阴性现象，导致结果误判5-6。目前，我国食品微生物学检验标准GB 4789系列除了传
12、统的生化检验方法，部分还采用了生化试剂盒、全自动微生物鉴定仪或分子生物学方法，弥补了单一方法的不足，保证了标准方法的实用性、准确性和科学性6-7。我国铜绿假单胞菌检验方法食品安全国家标准除了本身传统生化检验方法的缺陷外，也缺少其他鉴定方法的标准化应用。一些学者分析了非标方法对铜绿假单胞菌鉴定准确性时仅考虑了方法的包容性，但分析菌株样本较少，且较少考虑优化现行的标准方法7-8。本研究依据现行的标准方法分离鉴定的1株铜绿假单胞菌的假阳性菌恶臭假单胞菌，分析比较了优化后传统生化方法、API20E试剂盒、VITEK2系统以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）方法排除该假阳性的
13、适用性，并将上述鉴定方法应用于检验38株不同来源的铜绿假单胞菌和可能造成干扰的阴性菌，以期为方法的标准化应用和铜绿假单胞菌检验标准的完善提供参考。1材料与方法1.1材料1.1.1样品与菌株来源水样A，某品牌桶装饮用水。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC9027：美国Microbiologics公司；铜绿假单胞菌CM-CC 10104：中国医学细菌菌种保藏中心；铜绿假单胞 菌CICC 21946、杀 鲑 气 单 胞 菌（Aeromonassalmonicida）CICC 23934、溶血不动杆菌（Acineto-bacter haemolyticus）CICC
14、21949、门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）CICC 21629、粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）CICC 10981、产碱假单胞菌（Pseudomonas alcaligenes）CICC 23927、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）CICC 21620、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）CICC 20575、洋葱假单胞菌（Pseudomonas cepacia）CICC 20699、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）CICC 23621：中国工业微生物菌种保藏管理中心。3
15、5株铜绿假单胞菌野生株，编号P1P35，在CN平板上菌落特征：菌株P1P12为非蓝/绿色、产荧光菌落，菌株P13P23为蓝/绿色菌落，菌株P24P35为浅黄（绿）色菌落，来源于桶装饮用水样品，依据GB 85382016方法分离鉴定，并保藏于本实验室。1.1.2主要试剂营养琼脂、假单胞菌琼脂基础（Cetrimide-Nalidixic acid，CN）培养基、绿脓菌素测定培养基、乙酰胺液体培养基、钠氏试剂，均购自北京陆桥生物技术有限公司；API 20E鉴定试剂盒、VITEK2革兰阴性菌鉴定卡为法国梅里埃生物公司产品。混合纤维素微孔滤膜（孔径0.45 m，直径47 mm）为泰林生物技术有限公司产品
16、。1.2方法1.2.1铜 绿 假 单 胞 菌 的 分 离 鉴 定参 照GB85382016食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法“57铜绿假单胞菌”方法9对水样A中铜绿假单胞菌进行分离鉴定。1.2.2阳性菌确认对标准方法分离得到的铜绿假单胞菌阳性菌株进行纯化和镜检，参照文献10方法由上海生工生物工程股份有限公司完成纯培养物的测序，在NCBI中进行比对，并用Mega5.1软件，采用Neighor-Joining法构建系统发育树。分别参照API 20E肠杆菌和其他非苛养革兰阴性杆菌鉴定试剂盒和VITEK2革兰阴性菌鉴定卡操作说明进行鉴定；采用甲酸提取法11，用Microflex LT MALDI-TOFMS（德国布鲁克公司）上机鉴定，并重复试验1次。1.2.3铜绿假单胞菌检验方法的标准优化将经已确认的铜绿假单胞菌假阳性菌株接种于CN琼脂平板，36培养24 h，分别进行“42生长试验”和“硝酸盐还原产气试验”，并设置阳性对照（铜绿假单胞菌CICC 21946）和空白对照。1.2.4不同鉴定方法用于铜绿假单胞菌的检测以3株铜绿假单胞菌的标准菌株、35株野生菌和9株阴性标准菌株为试验菌株，分别
