1、农业环境科学学报Journal of AgroEnvironment Science2022，41（12）:2705-27102022年12月浦喆，杨新瑶，于丹，等.酸适应降低鼠伤寒沙门氏菌在天然土壤中迁移能力J.农业环境科学学报,2022,41（12）：2705-2710.PU Z,YANG X Y,YU D,et al.Acid adaptation reduces the transport ability of Salmonella typhimurium in natural soilJ.Journal of Agro-Environment Science,2022,41（12）：
2、2705-2710.开放科学OSID酸适应降低鼠伤寒沙门氏菌在天然土壤中迁移能力浦喆，杨新瑶*，于丹，张琦（沈阳大学区域污染环境生态修复教育部重点实验室，沈阳 110044）Acid adaptation reduces the transport ability of Salmonella typhimurium in natural soilPU Zhe,YANG Xinyao*,YU Dan,ZHANG Qi（Key Lab of Eco-restoration of Reginal Contaminated Environmental（Shenyang University）,Mini
3、stry of Education,Shenyang 110044,China）Abstract：Based on a soil column transport experiment,this study investigated the transport mechanism of Salmonella typhimurium,whichunderwent adaptive changes in an acidic environment（pH=5）.The results showed that acidic environment increased the particle size
4、 andconcentration of lipopolysaccharide（LPS）in the extracellular membrane of Salmonella typhimurium and decreased the concentration ofextracellular polymer（EPS）.These physiological changes in the extracellular membrane structure decreased the electronegativity ofbacterial Zeta potential and increase
5、 its hydrophobicity,thereby changing the transport mechanism of Salmonella.Column experimentresults showed that the transport ability of Salmonella decreased after their adaptation to acid stress.The reason was that the acidadaptability reduced the electrostatic repulsion between Salmonella and the
6、surface of the sand medium and enhanced their hydrophobicadsorption.Both mechanisms promoted the deposition of Salmonella on the sand surface.The energy barrier and the second minimumdepth in the XDLVO（extended Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek）curve indicated that the settlement of Salmonella on the
7、 sandsurface was a reversible process.The results of this study show that the changes in the surface physiological characteristics of Salmonellaunder acid stress would inhibit their transport in soil,thereby reducing the risk of Salmonella transmission in an acidic environment.Keywords：Salmonella;ac
8、id adaptability change;surface property;transport;XDLVO model收稿日期：2022-11-19录用日期：2022-12-01作者简介：浦喆（1998），男，辽宁大连人，硕士研究生，从事土壤病原菌运移行为研究。E-mail：*通信作者：杨新瑶E-mail：xinyao_基金项目：国家自然科学基金面上项目（42177406）；辽宁省“百千万人才工程”人选资助项目Project supported：The National Natural Science Foundation of China（42177406）；Baiqianwan Tal
9、ent Program of Liaoning Province，China摘要：基于土柱迁移实验，本研究在酸性环境（pH=5）下研究了发生适应性变化的鼠伤寒沙门氏菌的迁移规律。实验结果表明，酸性环境会导致鼠伤寒沙门氏菌的粒径和胞外膜脂多糖（LPS）浓度增加，胞外聚合物（EPS）浓度降低。这些胞外膜结构的生理变化会引起细菌Zeta电位负电性降低，疏水性增加，进而改变沙门氏菌的迁移规律。柱实验的结果显示沙门氏菌在发生酸适应性改变后迁移能力下降，其原因在于酸适应降低了沙门氏菌与沙介质表面的静电排斥，增强了疏水吸附，两种机制均促进沙门氏菌在沙表面的沉积。XDLVO（extented Derjagui
10、n-Landau-Verwey-Overbeek）曲线中能量势垒和第二最小值深度表明沙门氏菌在土壤沙表面的沉降为可逆过程。本研究结果表明，酸性环境胁迫下沙门氏菌表面生理特征的改变会抑制其在土壤中的迁移，从而降低酸性环境中沙门氏菌的传播风险。关键词：沙门氏菌；酸适应性改变；表面性质；迁移；XDLVO模型中图分类号：Q935文献标志码：A文章编号：1672-2043（2022）12-2705-06doi:10.11654/jaes.2022-1185农业环境科学学报第41卷第12期环境中的病原性微生物包括病毒、原生动物、细菌等，共超过100种，它们可通过动物的粪便进入环境中1。近年来，粪便有机肥的
11、施用及雨水的淋洗作用，使得病原性肠道菌进入土壤和水环境，造成环境污染2。人摄入受病菌污染的食品和水，将会产生不同类型的食源性疾病。沙门氏菌是一种主要的肠道致病菌，每年在全美引起约120万人患病。世界卫生组织基于致死率、耐药性风险、传播性、可防治性等指标，将沙门氏菌列为高优先级病菌。肠道病菌在土壤和地下水中的迁移传播是引起水致疾病暴发的重要过程。迁移过程受胞外聚合物（EPS）、脂多糖结构（LPS）和胞外膜蛋白等结构与多孔介质颗粒表面的交互作用控制。这些胞外膜结构携带氨基、羧基、羟基等官能团，使得细菌表面带有电荷，通常情况下细菌带有负电。地下水和土壤介质，如石英砂、土壤等，也带有负电荷。因此，细菌
12、和土壤颗粒之间通常存在静电斥力，这是影响细菌迁移的主要因素3。细菌表面的疏水性也可通过影响细菌与多孔介质之间的吸附作用来影响细菌的迁移行为。疏水性强的细菌，迁移能力通常较弱3-4；细菌的形状和大小也影响细菌在介质中的吸附和筛滤行为5，通常情况下，大颗粒细菌相比小颗粒细菌更容易发生沉降3，6。最新研究表明，细菌为了适应贫营养条件会改变其胞外膜结构3-6。鉴于胞外膜结构对细菌迁移的影响，这一研究结果意味着同一细菌在不同的环境条件下可能获得不同的迁移能力。而另一方面，pH等其他环境因子的影响尚不清楚。pH作为一个重要的环境因子，在天然水体和被污染水体中往往不同，酸雨渗滤、矿山废水污染和有机酸含量高的
13、土壤往往具有较低的pH，酸性条件对沙门氏菌表面的生理结构会产生什么影响，细菌的酸适应如何影响其在土壤中的迁移，这些问题的探索，对于更精准地预测细菌在这些环境中的迁移归趋十分重要。针对上述问题，本研究将在pH=5的酸性条件培养酸适应的鼠伤寒沙门氏菌，并以此为研究对象，通过柱实验和XDLVO模型，定量比较发生酸适应性改变前后鼠伤寒沙门氏菌在地下饱和多孔介质中的迁移行为，理解酸性条件对沙门氏菌胞外膜结构以及迁移能力的影响。1材料与方法1.1 鼠伤寒沙门氏菌培养与表征将活化后的鼠伤寒沙门氏菌（中国医学菌种保藏中心，编号50115）配制成6.1107CFUmL-1的菌液。将1 mL菌液分别加入100 m
14、L pH=7和pH=5的LB培养基中混合后于37 150 rmin-1下恒温振荡12 h至菌液浊度发生明显变化（离子强度为85.47 mmolL-1NaCl），得到原始状态的沙门氏菌和发生酸适应性改变的沙门氏菌，与 50%甘油混合后于-80 冷冻保存。得到的菌悬液于8 000 rmin-1离心10 min分离细菌与甘油。用超纯水清洗23次后将离心后的细菌用超纯水悬浮并调节菌液OD600值至0.2，分别使用Zetasizer和接触角测量仪测量沙门氏菌的Zeta电位、粒径和疏水性。将两种沙门氏菌悬浮液在经离心处理后配制成相同浓度的悬浮液，与乙二胺四乙酸二钠溶液2 3混合后于4 静置30 min7-
15、8。静置后在4、10 400g的转速下冷冻离心 50 min7，沉淀物过 0.45 m 无菌滤膜，保存上清液，使用考马斯亮蓝法测定上清液中细胞粘附蛋白的浓度（标准曲线：y=0.005 28x+0.003 37，R2=0.999 02）。将相同浓度的细胞悬液在50 W、20 s下进行破碎7，9-10，将破碎后的细胞悬液于4、10 000g的转速下冷冻离心40 min7，上清液过0.22 m滤膜后使用苯酚-硫酸法测定上清液中LPS的浓度（标准曲线：y=0.005 76x+0.000 315 295，R2=0.999 92）11。1.2 土壤沙预处理与表征土壤样品采集于沈阳大学校园的树林内，采集深度
16、为3050 cm12。干燥后去除植物残余的根系和树叶并过10目筛。将干燥的土壤样品与超纯水（Milli-Q water，Merck，法国）1 10 混合，振荡 24 h，过 0.45m PES亲水滤膜得到土壤溶解性有机物溶液。通过IC、ICP-MS测定土壤中无机物组成。称取10 g风干的土壤样品，加入25 mL 0.01 molL-1CaCl2磁力搅拌30 min后使用pH计测定土壤悬液的pH，经测定土壤悬液的pH为8.5。清洗过筛的土壤样品至洗液清澈，以去除其表面的有机物和其他杂质，于 60 下烘干得到土壤沙。使用Masterszier（Mastersizer2000 Malvern，英国）测定沙子的粒径分布并计算多孔介质的曲率系数与不均匀系数。分别使用土壤有机物溶液和模拟背景溶液作用流动液，使用 ZetaCAD（CAD Instruments，法国）测定土壤沙的Zeta电位，以作为XDLVO参数使用。1.3 柱实验将内径为1 cm的玻璃层析柱（C10/10，GE Healthcare，Piscataway，美国）在超声下湿法填充3 cm厚土壤沙，确保填充过程及实验过程中无气泡进入系
