1、Pumilio家族基因诱导性敲除小鼠模型的构建梁海波，邓晓凤，臧敏，赵婷婷*南京医科大学生殖医学与子代健康全国重点实验室，江苏南京211166摘要 目的：为探究出生后Pumilio家族的功能及其缺失对个体的影响，构建Pumilio1（Pum1）和Pumilio2（Pum2）双基因诱导性敲除的小鼠模型。方法：通过小鼠交配实验得到R26ERT2Cre/+Pum1flox/floxPum2-/-小鼠，并将同窝雄鼠设为对照组和实验组。分别对实验组3周和成年小鼠注射他莫昔芬，在DNA、RNA和蛋白水平表征主要脏器中Pum1的敲除效果；并表征精子发生过程中的病理变化、细胞增殖及凋亡情况。结果：实验组3周和
2、成年雄鼠的胸腺和睾丸组织中Pum1表达水平极低，敲除效率均高于50%，Pum1和Pum2双基因诱导性敲除小鼠模型构建成功。在注射他莫昔芬结束的第21天，3周雄鼠胸腺、脾脏和睾丸的重量明显下降，睾丸病理HE染色实验显示精子形成障碍，TUNEL和BrdU染色后计数结果显示睾丸中生精细胞凋亡增加、增殖减慢。成年小鼠在注射他莫昔芬恢复后，Pum1在胸腺、心、肝、睾丸中的表达仍有降低，但睾丸病理HE染色显示精子发生未见异常。结论：该模型的建立首次展示Pumilio家族蛋白作为未来药物靶标的潜能，为深入研究Pumilio的功能及作为肿瘤治疗靶蛋白的研究奠定了理论基础。关键词 Pumilio；诱导性敲除；他
3、莫昔芬；生殖；小鼠中图分类号 Q78文献标志码 A文章编号 10074368（2023）08105506doi：10.7655/NYDXBNS20230803An inducible knookout mouse model for Pumilio gene familiyLIANG Haibo，DENG Xiaofeng，ZANG Min，ZHAO Tingting*State Key Laboratory of Reproductive Medicine and Offspring Heaith，Nanjing Medical University，Nanjing 211166，China
4、Abstract Objective：To determine the roles of Pumilio family in the postnatal development，we established the Pumilio1/Pumilio2（Pum1 and Pum2）inducible knockout mouse model.Methods：Pum1flox/floxPum2-/-mice were mated with R26ERT2Cre/Cre mice toobtain R26ERT2Cre/+Pum1flox/floxPum2-/-mice.The experiment
5、 group（three week old mice and adult mice）was injected with tamoxifen，while the control group was injected with the same amount of peanut oil.The knockout efficiency of Pum1 at DNA，RNA and proteinlevels of multiple organs in mice was determined.The histology of the testis as well as cell proliferati
6、on and apoptosis of the testicularcells were examined.Results：The Pumilio1 RNA and protein of thymus and testis were knocked down significantly.The knock downefficiency of Pum1 varies from tissues to tissues but reaching a minimum of 50%.The mouse model of Pum1 and Pum2 gene inducedknockout was succ
7、essfully constructed.The weight of thymus，spleen and testis of male mice in the 3week experiment group decreasedsignificantly，supporting the critical role of PUM in postnatal organ growth.The hematoxylin and eosin（HE），TUNEL and BrdUstaining of testis pathology showed disrupted spermatogenesis，increa
8、sed apoptosis and decreased proliferation of spermatogenic cellsin 3week experiment group testis.Although，the Pum1 of each organ in adult group was knocked down at different levels，thespermatogenesis of adult experimental group was not significantly affected.Conclusion：This inducible Pumilio knockou
9、t modelprovides a new tool to study the roles of Pumilio in postnatal and adult mice，and supports the future development of Pumilio aspotential drug targets for diseases involving Pumiliomediated translational control.Key words Pumilio；inducible knockout；tamoxifen；reproductive；miceJ Nanjing Med Univ
10、，2023，43（08）：10551060基金项目国家自然科学基金面上项目（31970792）通信作者（Correspondingauthor），Email：基础研究南京医科大学学报（自然科学版）Journal of Nanjing Medical University（Natural Sciences）第43卷第8期2023年8月1055南京医科大学学报第43卷第8期2023年8月Pumilio家族蛋白是一类高度保守的RNA结合蛋白，在哺乳动物中存在 Pumilio1（Pum1）和Pumilio2（Pum2）两种Pumilio蛋白，它们在结构上高度相似，并且在靶标及功能上存在冗余 1。Pum
11、1、Pum2蛋白参与胚胎发育 2、生殖细胞发育 3、细胞周期进展 4、神经反应 5 和记忆形成 6 等生理过程，尤其与神经退行性疾病、癌症等人类疾病的发生发展有着重要的联系。目前研究报道，Pumlilio通过不同途径调控多种肿瘤的发生发展7，Pum1在卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌和结肠癌中高表达，通过多种调控轴来影响肿瘤的增殖、转移和侵袭等 8-12；Pum2在子宫颈癌、乳腺癌和膀胱癌中的高表达预示着更短的生存期 13-15，Pum1和/或Pum2在肿瘤细胞中的降低，可影响相应的肿瘤抑制因子，进而影响肿瘤的生长 16-17。因此，Pumilio是否可以作为肿瘤治疗靶标蛋白的关键，是其缺失对生命机体
12、的影响大小。由于Pumilio对于细胞的早期分化以及原肠胚形成过程至关重要，Pumilio双敲小鼠在胚胎期8.5 d死亡 3，出生后Pumilio对个体影响及功能研究显得尤为重要。本 研 究 利 用 R26 CreERT2小 鼠 与 Pum1flox/floxPum2-/-小鼠进行交配获得基因型为R26ERT2Cre/+Pum1flox/floxPum2-/-的雄鼠，注射他莫昔芬建立了诱导性全身Pumilio基因敲除小鼠模型，通过PCR、Western blot和RTPCR技术表征各组织敲除效果，以及对重要器官重量、睾丸病理改变、生殖细胞增殖和凋亡等结果进行分析，探索他莫昔芬诱导的小鼠各器官中
13、 Pum1 敲除情况和雄性生殖系统受到的影响，为深入研究Pumilio在出生后的功能和肿瘤治疗提供了重要依据及关键的研究工具。1材料和方法1.1材料R26CreERT2小鼠购自美国麻省理工大学的TylerJack实验室。Pum1诱导性敲除小鼠是在Pum1基因的第9和第10号外显子的两端插入loxp序列，Pum2敲除小鼠是在第10和第11外显子之间插入geo基因造成基因缺陷。小鼠饲养于南京医科大学医药动物实验中心生殖医学国家重点实验室模式动物研究基地SPF级动物房，室温控制在2022，湿度5070，光照周期12 h/12 h。饲养过程中保持充足食物和水，垫料每周更换1次。繁殖采用1只雄鼠和2只雌
14、鼠同笼的方式进行。实验动物使用获得南京医科大学实验动物福利伦理审查委员会同意（IACUC19030521）。1.2方法1.2.1基因型鉴定收取各组织后，剪下少量器官组织溶于50mmol/LNaOH 溶液，沸水浴 30 min。冷却后加入 20 L1 mol/L的TrisHCl（pH8.0）于涡旋仪混匀，12000r/min离心5 min，取上清液进行PCR扩增。目的片段的扩增序列和凝胶成像的产物大小见表1。1.2.2BrdU实验将切片按以下顺序和时间处理：切片脱蜡和水化；去除内源性过氧化氢酶，3%H2O2浸泡10 min。ddH2O洗3次，每次5 min；胰蛋白酶消化液37 8 min，ddH
15、2O 2 min3次，37 ddH2O 5 min；2N HCl 37 30 min；0.1 mol/L Borax 10 min，ddH2O 2 min3；50 mmol/L TrisHCl（pH=7.6）5 min2，ddH2O 2 min3；封闭、抗体孵育、显色、苏木素染色、脱水、封片。1.2.3Western blot检测小鼠主要脏器的敲除效率取小鼠脑、胸腺、心、肝、脾、睾丸各约10 mg，分别加入约200 L RIPA强裂解液，匀浆后冰上裂解，每 10 min 漩涡震 1 次，共 3 次，冰上静置 20 min，4，20 000 g 离心 30 min 后取上清液即总蛋白。浓度为10
16、%的单一胶分离蛋白，湿转到硝酸纤维素膜（nitrocellulose filter membrane，NC）上，用含6%脱脂奶粉的TBST封闭1 h，然后加入抗PUM1（1 500）抗体在4 孵育过夜。次日用TBST液洗3次，每次10 min，加入二抗后室温孵育1 h，ECL化学发光仪曝光。表1小鼠基因型测定引物序列Table 1Sequences of primers used for genotyping引物名称KOF1（P1）KOR1（P1）LOXGTR（P1）XEF（P2）XER（P2）XEKOR（P2）引物序列（53）CAT GAG TTT GGG AGG CAT TTGTG GCT AAC AAC TGC TGC AAGTC TTG TGG CAA CTA GGG TAACC AGC GTT TCT GGG TGAAAA TGG CAC CCA TCA TTG TTCCG TTG TCT GCA GTG TCT GT产物361 bp for Pum1WT allele453 bp for Pum1Flox allele557 bp for Pum1homo allele46
