1、黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报第 35 卷doi:10.3969/j.issn.1002-2090.2023.04.012第 35 卷第 4 期2023 年8 月黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural University35（4）：7480Aug.2023收稿日期：2022-11-10基金项目：黑龙江省自然科学基金联合引导项目（LH2019C046）作者简介：牛欣雨（1996-），女，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院 2020 级硕士研究生。通信作者：曹宏伟，女，教授，博士研究生导师，Emai
2、l：。PEDV Nsp10 基因真核表达载体的构建及蛋白的表达牛欣雨1，郑亮2，魏佳琪1，武峰峰1，吴志军1，3，张华1，2，3，曹宏伟1，2，3（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院；3.盐城师范学院）摘要：猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）为猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）的病原体。Nsp10 是 PEDV 编码的一种非结构蛋白，在病毒的复制过程中发挥着重要的作用。为研究在病毒侵染宿主细胞时 Nsp10 蛋白发挥的作用，通过 RT-P
3、CR 技术扩增 Nsp10 基因片段，利用同源重组的方法将 Nsp10 基因连接到 pCMV-Myc 载体，成功构建了 PEDV Nsp10 基因的真核表达载体。酶切鉴定及测序结果证实，PEDV Nsp10 基因成功克隆到 pCMV-Myc 载体中，并将重组质粒命名为 pCMV-Myc-Nsp10。将重组质粒 pCMV-Myc-Nsp10 通过脂质体转染至 IPEC-J2 细胞中，利用 Western Blot 和间接免疫荧光技术检测 pCMV-Myc-Nsp10 的表达以及定位情况。结果显示，pCMV-Myc-Nsp10 在 IPEC-J2 细胞中成功表达，并且均匀分布在细胞质和细胞核中，为
4、后续研究 PEDV Nsp10 蛋白的生物学功奠定了基础。关键词：猪流行性腹泻病毒；真核表达载体；Nsp10 蛋白；蛋白表达中图分类号：S852.651文献标识码：A文章编号：1002-2090（2023）04-0074-07Construction of Eukaryotic Expression Vector and ProteinExpression of PEDV Nsp10 GeneNiu Xinyu1，Zheng Liang2，Wei Jiaqi1，Wu Fengfeng1，Wu Zhijun1，3，Zhang Hua1，2，3，Cao Hongwei1，2，3（1.College
5、 of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University；3.Yancheng TeachersUniversity）Abstract：Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）was the pathogen of porcine epidemic diarrhea（PED）.
6、Nsp10 was a non-structural protein encoded by PEDV，which played an essential role in the replication of the virus.To study the role of Nsp10 proteinin virus infection of host cells，Nsp10 gene fragment was amplified by RT-PCR technology and connected to the pCMV-Myc vectorby double enzyme digestion，t
7、he eukaryotic expression vector of PEDV Nsp10 gene was successfully constructed.Enzyme digestionidentification and sequencing results confirmed that the PEDV Nsp10 gene was successfully cloned into the pCMV-Myc vector，andthe recombinant plasmid was named after pCMV-Myc-Nsp10.The recombinant plasmid
8、pCMV-Myc-Nsp10 was transfected intoIPEC-J2 cells by liposome，and the expression and localization of pCMV-Myc-Nsp10 by Western Blot and indirectimmunofluorescence were explored.The results showed that pCMV-Myc-Nsp10 was successfully expressed in IPEC-J2 cells andevenly distributed in cytoplasm and nu
9、cleus，which would provide a theoretical basis for subsequent studies on the biologicalfunctions of PEDV Nsp10 protein.Key words：PEDV；eukaryotic expression vector；Nsp10 protein；expression of protein猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起一种急性肠道传染病，主要以高度接触性传染而广泛传播1。感染此病毒的猪多伴有严重的腹泻、呕吐、脱水等特征，多感染哺乳仔猪，且具有较高的感染率和死亡率。不同年龄段的猪感染率不
10、同，但一般年龄越小的猪感染率越高，死亡率也越高2。猪流行性腹泻首次爆发于欧洲英国，但目前已经成为威胁到包括中国、韩国、日本等在内的亚洲各个国家养猪业的严重第 4 期传染性疾病，给亚洲乃至世界各国养猪业造成了致命性的打击3。PEDV 是一种正链单股 RNA 病毒，基因组全长约为 28 kb4-6。PEDV 基因组共编码蛋白 21 种，其中包括 4 种结构蛋白（E 蛋白、M 蛋白、N 蛋白及 S 蛋白）和 16 种非结构蛋白 Nsp1-16 以及一个辅助蛋白ORF37-9。这些蛋白共同协调着病毒的复制与增值。Nsp10 是 PEDV 编码的非结构蛋白，由 135 个氨基酸残基构成，是一种具有核苷-
11、2-O-甲基转移酶活性的辅助蛋白10。生物信息学分析发现 Nsp10 蛋白是一种锌指结合蛋白，在冠状病毒（包括玉、域、芋型）中，和锌螯合的所有氨基酸均比较保守11。此外，也有研究表明，SARS-Cov Nsp10 蛋白可以与 DNA或单双链 RNA 中非特异性的核苷酸结合并且可通过与多种蛋白如 Nsp1、Nsp7 等相互作用来参与复制复合体的形成12-13；SARS-Cov-2 Nsp10 蛋白可以拮抗玉型干扰素产生的免疫应答反应14；MHV Nsp10蛋白可以结合锌离子并且在体外与 ssDNA、dsDNA、ssRNA 及 tRNA 结合15；冠状病毒的 Nsp10 蛋白是一种可以激活多种复制
12、酶的关键辅助因子，它可以与Nsp14 和 Nsp16 相互作用，并调控它们各自的外显子和核糖-2-O-甲基转移酶的活性16-17；猪 啄 冠状病毒Nsp10 蛋白以一种不依赖于锌指结构域的方式拮抗茁-干扰素的产生18。这些结果说明，对于冠状病毒来说 Nsp10 蛋白对基因组和亚基因组 RNA 合成以及病毒多聚蛋白的加工有着极其重要的作用19-20。到目前为止，对于冠状病毒 Nsp10 作用机制研究的报道还相对较少，对于 PEDV Nsp10 蛋白的研究也相对较少。研究通过构建 PEDV Nsp10 基因真核表达载体，利用免疫印迹技术（Western Blot）与间接免疫荧光技术鉴定其表达及亚细
13、胞定位情况，为进一步探究 PEDV Nsp10 蛋白的生物学功能以及特性奠定了一定的基础。1材料与方法1.1 材料IPEC-J2 细胞由生物技术中心 509 实验室于-80 益冻存复苏；小鼠抗 Myc 单抗（mAb）、小鼠抗 茁-actin单抗（mAb）、山羊抗小鼠辣根酶标记 IgG 以及 FITC标记的山羊抗小鼠 IgG 均购自北京中衫金桥生物技术公司；DMEM 培养基、胎牛血清（fetal cattle serum，FBS）和 LipofectamineTM2000购自英潍捷基（Invitro原gen）上海贸易有限公司；质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒均购于 Omega 公司；限制性内切酶 E
14、coR玉和Xho玉、2伊Seamless 无缝克隆酶、PCR 及反转录试剂盒购自 TaKaRa 公司；特异性引物合成及重组质粒的序列测定均由擎科生物（北京）公司完成；病变组织猪小肠由生物技术中心 509 实验室保存；试验选用的 DH5琢 感受态细胞及所需的 pCMV-Myc 载体均由生物技术中心 509 实验室保存。1.2 引物设计及表达载体构建路线找出已经发表在 NCBI-GeneBank 上的 PEDV（NC_003436.1）标准序列作为模板序列，利用 primer5 软件设计 PEDV Nsp10 基因的特异性上下游引物，特 异 性 上 游 引 物 序 列：GCCA TGGAGGCCC
15、原GAATTCGGATGGCTGGTAAACAAACAGAACAGGC-TAT-3（含 EcoR 玉位点），特异性下游引物序列：CGCGGCCGCGGTACCTCGAGATTGCATAATGGAT-CTGTCACAAG TG（含 Xho玉位点）。利用酶切连接的方式将 PEDV Nsp10 基因插入 pCMV-Myc 的 EcoR玉/Xho玉位点之间。构建以 pCMV-Myc 为载体的PEDV Nsp10 蛋白融合表达载体。1.3 扩增 PEDV Nsp10 基因将病变组织猪小肠用液氮进行研磨，将其放于1.5 mL EP 管中，剧烈摇晃 1 min 后静止 10 min，加入冰冷的三氯甲烷试剂，
16、快速摇晃 20 s。静止 15 min后，在转速为 12 000 r min-1，4 益离心机中离心15 min。离心停止后，取离心管中的上层澄清液于新的 EP 管内，将 600 滋L 异丙醇加入装有上述澄清液的 EP 管中，轻轻摇晃 15 s，让两者混匀，静止时间为10 min。随后 4 益离心机中离心 10 min，转速为12 000 r min-1。倒掉上清，向沉淀中加入 75%的乙醇（用 DEPC 水现配现用）600 滋L，静止 10 min。倒掉上清，吹干剩余液体，向 EP 管中的沉淀加入 20 滋L 的DEPC 水助溶，静止 10 min，在-80 益冰箱中保存。试验过程中所用的耗材需要提前用 DEPC 水处理，4 益离心机需提前预冷。RNA 提取完毕后，加入 Oligo（dT）1 滋L、SpecificPrimer 2 滋L、DEPC 水 2 滋L；反应条件为 70 益 10 min。向上述管中加入以下试剂混合液，dNTP mix（10 mM）0.5 滋L、RNase Inhibitor 0.5 滋L、5 伊M-MLV buffer2 滋L、RNase M-MLV 1 滋
